1.7研究工作的发展和应用前景

寻找能够降低卵巢癌细胞抗药性的化合物作为卵巢癌治疗的伴侣药物是目前医学界的一个热门课题，本研究旨在构建一种筛选抗PDI因子的细胞水平上的生物系统。本研究采用基因敲除、基因置换和构建报告基因等一系列技术手段来构建抗PDI因子（Anti-PDI Factor, 简称APF）的生物检测系统，最终通过细菌报告基因表达来指示待测物质的抗PDI活性。

研究成果主要有以下两个用途：第一，从天然或者合成的化合物中筛选抗PDI因子，恢复肿瘤细胞的药敏性，用于卵巢癌的伴侣治疗；第二，在此基础上，努力发现引起PDI上调的其它病理，并用该方法探索性进行其它与PDI有关疾病的伴侣治疗。

总体而言，该系统的构建是卵巢癌等疾病治疗由手术治疗向药物控制治疗转变的一个重大突破，是具有药物的化合物药物产业化的前期工作阶段，且该研究具有操作简单、成本低廉、容易产业化等特点，具有很强的科研价值和市场前景。

2.实验

   2.1实验目的

目前人体PDI的检测方法主要是单独的酶法检测，虽然该检测方法简单，易操作，但是由于在非生理环境，检测结果是否适用于生物环境，还需要再验证。本研究的意义在于通过生物技术构建一种简单实用的方法来筛选抗PDI因子，所以本研究要达到的目的就是构建一种抗PDI因子的生物检测系统，应用该系统能够准确的筛选出抗PDI因子，制备回复卵巢癌药敏性的口服小分子辅助药物。

本毕业设计只涉及抗PDI因子生物检测系统构建的前两步，即抗PDI因子的化学合成和大肠杆菌中与人体中PDI相对应的dsbA的敲除。所以要通过本毕业设计达到以下目的，首先要培养实验操作者的基本实验操作能力，熟练掌握有机合成和基因敲除的实验操作，另外本毕业设计要成功合成抗PDI因子和对大肠杆菌的dsbA基因的敲除，为构建抗PDI因子生物检测系统的后续工作打下坚实的基础。文献综述

   2.2实验原理

本研究拟采用基因敲除、基因置换和构建报告基因等一系列技术手段来构建抗PDI因子（Anti-PDI Factor, 简称APF）的生物检测系统，最终通过细菌报告基因表达来指示待测物质的抗PDI活性。

首先，将大肠杆菌内源的二硫键异构酶编码基因dsbA置换为人源PDI编码基因hPDI。

其次，融合表达malF-lacZ元件，MalF在PDI作用下发生折叠，将其下游LacZ引入周质空间，由于LacZ富含半胱氨酸，在周质空间容易被PDI氧化形成错误的结构，而失去催化X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）成蓝色的能力。当细胞周围含有APF时，PDI被抑制，LacZ在细胞质中可以正确折叠，具有催化X-gal成蓝色的能力，根据颜色的变化即可检测APF的活性。

由于大肠杆菌的DsbA与人体的PDI为同工酶，它们都能对MalF进行蛋白折叠，导致LacZ被输送到周质空间发生错误折叠而失去活性，不能催化X－gal显示蓝色，所以在使用大肠杆菌作为载体菌株之前需要对它的dsbA进行敲除。