2 材料与方法

2.1 材料

阳性质粒DNA (含有NPTⅡ基因），待测样品为水稻颗粒均有由老师提供。

2.2 试剂与耗材

DNA抽提试剂盒、定性PCR所用Taq酶、dNTP、MgCl2、定量PCR所用2x GoldStar  TapMan Mixture(with ROX)、电泳用DNA ladder maker均由康为世纪公司提供。定性及定量PCR引物、探针均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

2.3 仪器设备 

 普通PCR扩增仪、实时荧光PCR扩增仪、电泳槽和电泳仪等电泳装置、凝胶成像系统等。

2.4 方法

2.4.1 DNA的提取与纯化 

实验步骤如下：

（1）将水稻颗粒使用美的搅拌机（MJ-BL25B2）粉碎成粉末状，称取0. 2 g粉末装入液氮预冷的2mL离心管中，加入400μl Buffer GF1和4μlRNaseA(100mg/ml)，涡旋振荡1分钟，使其充分裂解。

（2）65℃孵育10分钟，期间涡旋混匀2~3次。

（3）加入130μl Buffer GF2，混匀，冰上孵育5分钟。

（4）将所得液体转移到已装入收集管的过滤柱中，14000rpm离心2分钟，收集滤液。

（5）将收集管中收集到的滤液转移到一个新离心管中。

（6）加入1.5倍体积的Buffer GF3 (使用前检查是否已加入无水乙醇），充分混匀。

（7）将步骤6中所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，若一次不能加完                 溶液，可多次转入，10000rmp离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。

（8）向吸附柱中加入500μl Buffer GW（使用前检查是否已加入无水乙醇），10000rpm 离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

（9）重复步骤8。

（10）12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。来~自^751论+文.网www.751com.cn/

（11）将吸附柱放到一个新离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50~100μl Buffer GE或灭菌水，室温放置2-5分钟，10000rpm离心1分钟，收集DNA溶液。-20℃保存DNA。

2.4.2引物序列

根据引物合成的原则，通过使用引物合成软件，分别合成定性及定量引物，引物序列详见下表。

2.4.3 PCR检测 

（1）定性PCR扩增

 PCR技术是一种体外扩增技术，在引物、模板DNA和C、G、A、T核苷酸存在的条件下，进行的聚合酶的酶促反应，通过酶促反应，使DNA片段在数量上呈指数增加的技术，使用该技术能在短时间内获得大量的特定基因片段。 本研究根据实验室的一贯实验习惯，采用25ul反应体系进行PCR扩增，