本文会主要阐述分离出多菌灵农药降解菌VU-G的过程，并对此菌株的性质进行鉴定，研究其生长特性。本实验最重要的步骤就是一开始的分离筛选，因为土壤中会有很多杂菌，严格地控制富集、驯化培养的条件才能正确地分离出目的菌。而对于分离得到的菌株的鉴定和生长特性的测定也有利于我们对目的菌的了解。只有对分离所得的菌有了透彻良好的了解，我们才能更好地将其应用。这样投入生产实践应用的过程中，不论是对菌的培养还是投入工业化降解都能有一个良好的把握。这既丰富了微生物资源，又对环境保护，食品安全等起了重大的意义。

1材料与方法

1.1供试材料

1.1.1土壤样本来源

土壤获取来源为徐州市长期使用多菌灵农药的农田土壤。

1.1.2农药及试剂

多菌灵标准品由新沂农药厂提供，其他试剂为实验室共同购置的产品，且都为纯净物。

1.1.3培养基

无机盐培养基[13]：MgSO4.7H2O 0.2g, NaCl 0.5g, K2HPO4 1.5g, NH4NO3 1.5g, KH2PO4 0.5g，加蒸馏水至1L，不需调pH；富集培养基：无机盐培养基经过灭菌后加入适量的多菌灵，作为富集培养和驯化培养用，以筛选和分离菌株；LB固体培养基：NaCl 10g，胰蛋白胨10g，酵母粉5g，琼脂粉20-22g，加水至1L，pH 7.2~7.5之间。以上培养基都在121以高温下灭菌20min，备用。

1.2具体实验项目方法文献综述

1.2.1多菌灵农药降解菌的富集、驯化培养和筛选

取10g左右的土壤放入容量为250mL的锥形瓶中，加入含有50 mg/L多菌灵的无机盐培养基100mL，摇床培养（30℃，180r/min）5天。之后按10%的接种量进行富集、驯化培养。取最后一次富集培养上清液涂布于无机盐固体培养基上，并做一个不含多菌灵的平板作为对照，挑取含有多菌灵的无机培养基平板上生长良好的菌株，LB纯化后冷冻保藏备用。

1.2.2菌株培养条件的优化实验

采用控制变量的方法，分别来测定菌株在不同环境如不同初始pH值（4、5、6、7、8、9、10）培养基、不同通气量（50mL、100mL、150mL）、不同盐浓度（1%、3%、5%、7%、9%）培养24h后的OD200到OD600的值，所得负值取绝对值，所有数据取最大值，确定菌株在含50 mg/L多菌灵的无机盐培养基的最适培养条件。

1.2.3革兰氏染色

在载玻片中央滴一滴清水，挑取一些菌均匀地涂布，铺展开来，自然风干。风干后用酒精灯固定。用草酸铵结晶紫溶液染色1~2 min，冲洗，用碘液媒染1~2 min，75%乙醇冲洗30s，最后用番红染色，冲洗，显微镜观察菌的形状和颜色。

1.2.4 PCR扩增测序

选取菌株制成菌悬液，加入MIX，在适宜PCR反应体系和反应条件下对菌株基因组DNA进行扩增。反应结束后直接进行电泳检测。扩增得到的PCR产物3’端附有一个“A”碱基，因此可以直接用于T/A克隆，继而送进专门公司进行DNA序列测定。根据电泳图选取适宜长度的基因片段，用相关软件进行系统进化发育树的构建。

1.2.5 菌株碳源的测定

在无机盐培养基中分别加入甘露醇、纤维二糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、山梨醇和维生素B1这八种不同的营养物质作为碳源。选取菌株制成菌悬液，向不同培养基中加入菌悬液，摇床培养24h，观察反应结果，判断菌株对这八种营养物质的可利用程度。

1.2.6 电镜观测

先进行细菌电镜样品的快速制备：（1）将分离纯化的菌体挑入含有10mL LB液体培养基的摇瓶中，振荡培养12h；（2）培养后吸取800uL菌液离心，3000rmp离心3min，去上清，加入500uL PBS洗2-3次；（3）在沉淀中加入4%戊二醛1mL，充分混匀，4℃静置4h（时间应尽量延长，或过夜）；（4）3000rmp离心3min，去上清，加入500uL PBS洗2-3次（用PBS溶解菌体，用枪轻轻吹打，离心弃去PBS，再加入新的PBS，混匀离心）；（5）在沉淀中缓慢加入2%戊二醛500ul，充分混匀，4℃放置1h；（6）重复（2）的后半部分操作；（7）乙醇梯度脱水，20%，50%，80%，100%，每次脱水10min，3000rmp离心3min；（8）用100%叔丁醇置换100%乙醇2-3次，乙醇菌液离心后，去上清，加200uL 100%叔丁醇4℃放置30min，再溶于适量100%叔丁醇送样。一般一滴菌悬液即可，在锡箔纸上分散，挥发干即可进行电镜观察。来!自~751论-文|网www.751com.cn 多菌灵农药降解菌VU-G分离鉴定与生长特性研究(3):http://www.751com.cn/shengwu/lunwen_79016.html