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6.5 本章小结 39
结 论 40
致 谢 41
参 考 文 献 42
附录 16S rDNA测序结果 45
1 引言
1.1 NADH氧化酶
1.1.1 NADH氧化酶简介
NADH氧化酶（NOX），可在O2存在下将NADH氧化为NAD+，根据产物的不同，NOX可分为两类[1]:一类在反应过程中发生了2个电子的转移，产物为H2O2的称为NADH过氧化酶(NOX—1)。另一类在反应过程中发生了4个电子的转移，产物为H2O，即侠义的NADH氧化酶(NOX—2)。
目前已经从细菌中分离纯化出几种NADH氧化酶。从有氧条件下培养的粪链球菌中分离纯化出的NADH氧化酶，催化氧气还原为H2O，并发生4个电子转移；从厌氧条件下培养的粪肠球菌中分离纯化的NADH氧化酶，催化氧气还原为H2O2；从巨大芽孢杆菌和水生栖热菌Y-1中分离出的NADH氧化酶可通过催化氧气还原， 产H2O2，并发生2个电子转移。
对于产物为水的，副产物对反应无影响，操作简单、产物易分离，可用于再生NAD+，具有广阔的前景，是极具潜力的氧化态辅酶再生体系之一[2]。对于反应生成H2O2的，由于H2O2易使脱氢酶失活，如果用于再生NAD+，需要在体系中加入H2O2酶，这使得再生体系复杂化。而且在H2O2浓度低的情况下H2O2酶很难发挥其活性，所以NADH过氧化酶的应用也受到了限制。然而纯化的NADH氧化酶是极稳定的，并以非常高的速率催化H2O2的形成，它可应用于生物传感器[3]，在脱氢酶和电极间充当中介，该酶的潜在应用是值得进一步探讨。从嗜热菌中分离出的NADH氧化酶成为生物传感器研究的新热点，这是因为从嗜热菌中分离酶的高稳定性使酶电极具有更长的使用寿命。
好氧微生物中，NADH氧化酶的活性通常是由膜结合酶催化电子从NADH通过醌和细胞色素转移给O2的副反应产生的。因为氧气对专性厌氧微生物是有毒的，其消耗O 2的酶，如NADH氧化酶，以前就发现它并不明显地参与厌氧微生物的新陈代谢。然而，更多催化氧气还原的NADH氧化酶被发现存在于许多厌氧微生物，这些酶可能具有重要的生理功能。据表明，NADH氧化酶可以参与厌氧菌的NAD/ NADH比率调节，厌氧菌可利用NADH氧化酶来降低其意外暴露于氧气的环境中所产生的毒性[4]。
1.1.2 NADH氧化酶研究进展
（1）从1990年开始兴起有关酶的生物传感器的开发研究，催化氧化还原反应的相关酶类经常被应用到这方面的研究。如果反应的产物具有电活性，它们的浓度可依据安倍法进行测定。因此，该生物传感器的功能是基于测量氧消耗或过氧化氢的生成量。该生物传感器越来越多地应用到临床医学和生物技术领域。NADH氧化酶催化NADH氧化，同时将氧气还原。利用NADH氧化酶作为电极的优势于反应的特异性和敏感性，另外这是一种经济的NAD+再生的方法。
（2）Rongrong Jiang and Andreas S. Bommarius在2004年成功地应用了基于序列比较的方法从乳酸乳球菌中发现了可以将O2还原为H2O2的NADH氧化酶。NOX-1基因（AhpF）是从乳酸乳球菌基因组分离出DNA，通过PCR，克隆到表达载体pET32。将标记His的蛋白被167μM IPTG诱导后在20℃过表达，再用Co2+-IMAC纯化。纯化后，NOX-1被认为是一个脱辅基蛋白，所以通过添加FAD辅因子重组了黄素蛋白，发现FAD和NOX-1亚基是1:1的化学计量关系[7]。 虽然两种产物NAD+和H2O2都会抑制NOX-1的活性，但在H2O2浓度不高的情况下该酶会保持稳定。用Amplex Red滴定H2O2实验表明，NADH只有一半的电子参与H2O2的形成。
（3）Xianggqin和Kesen Ma[6]在2005年从极端嗜热厌氧细菌Thermotoga hypogea中提取NADH氧化酶，并对其纯化和表征。研究表明Thermotoga hypogea是一种能够在90℃生长的极端嗜热厌氧细菌。它被认为能够在微摩尔的分子氧的存在下生长。在T. Hypogea的游离提取物中检测NADH氧化酶的活性，从其中检测的NADH氧化酶被纯化。纯化的酶通过十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳，表明该酶是分子量为50kDa的同源二聚体。它用NADH作为特异电子供体催化氧气还原为过氧化氢。其催化性能表明：NADH氧化酶有一个明显的Vmax值：每分钟每毫克酶催化37μmolNADH氧化。NADH和O2的表观Km值分别是7.5μM和85μM。酶表现出最适PH为7.0和最适温度为高于85℃。NADH依赖性过氧化物酶活性也存在于无细胞游离提取物中，其可以减少由NADH氧化生成H2O的过程产生的H2O2。