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2.2.5 载体连接、转化、筛选 15
2.2.6 双酶切 16
2.2.7 序列分析 16
3 结果与分析 17
3.1透明质酸酶编码基因的克隆 17
3.1.1 PCR扩增马疫链球菌ATCC43079菌中透明质酸酶的结果 17
3.1.2 重组质粒pMD18T-HAase的构建 18
3.1.3 pMD18T-HAase质粒的验证结果 19
3.2透明质酸酶编码基因序列分析 20
3.2.1 HAase基因核酸序列分析 21
3.2.2 HAase基因推导的氨基酸序列分析 21
3.2.3 蛋白质结构分析 23
4 讨论与结论 27
4.1 讨论 27
4.2 结论 27
致谢 29
参考文献 30
附件1 HAase基因序列 32
附件2 HAase氨基酸序列 34
1 前言
1.1 透明质酸酶概述
透明质酸酶（hyaluronidase, HAase）是一类在动物组织和微生物中广泛存在的细胞外降解酶，是对催化降解透明质酸酶的通称。它可以特异性地断开透明质酸（hyaluronic acid，HA）中的β-N-乙酰氨基葡萄糖胺与D-葡糖醛酸盐之间的1，4-糖苷键，将其解聚和水解成低相对分子质量（Mr）HA或寡糖，降低HA的黏滞性和起到润滑作用，降低体内透明质酸的活性，从而提高组织中液体渗透能力[1]。
1.1.1 透明质酸酶的发现及分类
1928年Duran-Reynals在研究哺乳动物睾丸及其他组织提取物时发现了一种“扩散因子”，可以促进皮下注射的疫苗、染料、毒素等更好地扩散；1937年Meyer发现Ⅱ型肺炎链球菌可降解透明质酸（hyaluronic acid，HA）。随后，该“扩散因子” 也被鉴定是透明质酸酶，这两项研究使得透明质酸酶的发现成为可能[2]。此后研究发现，在蛇毒、蜂毒、蝎毒以及蜘蛛等的毒液中都存在透明质酸酶。此外，一些细菌、真菌以及非脊椎动物如水蛭、甲壳类动物等也产生透明质酸酶。透明质酸酶分布虽广，但在过去很长一段时间里由于分离纯化困难并没有得到很好地研究，是一类被忽视的酶。最近十几年来，人们对HA和透明质酸酶显示出了浓厚的兴趣，试图探求它们在众多生物学过程中的作用。
透明质酸酶是一种偏酸性蛋白酶，根据氨基酸序列的同源性，HAase可分为两大类：真核生物HAase和原核生物HAase。根据底物特异性和作用机制分为三大类：哺乳动物类透明质酸酶，细菌透明质酸酶，来自水蛭、其它寄生虫和甲壳类动物的透明质酸酶。1971年，Meyer根据HAase的作用机制与底物特异性，将其分为以下3类（表1-1）[3]。
表1-1 HAase的分类
Table 1-1 Classification of hyaluronidase
分类 来源 活性 作用底物 终产物
透明质酸-4-溶菌酶（EC 3.2.1.35） 睾丸，蜂毒，溶酶体 作用于β-1,4糖苷键，转糖苷酶 HA，软骨素，硫酸软骨素，硫酸皮肤素 四糖
透明质酸-3-溶菌酶（EC 3.2.1.36） 水蛭，钩虫唾液腺 作用于β-1,3糖苷键 特异性降解HA 四糖，751糖
透明质酸裂解酶 （EC 4.2.2.1） 微生物，如链球菌、梭菌等 作用于β-1,4糖苷键，消去机制 HA，软骨素 不饱和葡糖醛酸-N-乙酰己糖胺