运用张浩男(2011)等人[23]阐述的方法。从高阳棉田采集棉铃虫雄蛾和雌蛾,交配
后得F1代。F1代试虫经1μg/cm2 Cry1Ac毒素筛选,存活试虫饲养至成虫。存活个体与敏感品系(SCD)单对杂交,得F2代。F2代经1μg/cm2 Cry1Ac筛选后混交,其后代再进行筛选多次,得到较纯的高抗品系(GY♀30)。该品系成虫与实验室内敏感品系(SCD)单对测交,子代在区分剂量下进行筛选,检测其纯化度。
图1 GY♀30品系的分离方式
1.4 高通量筛选法
(1)移取60℃左右的人工饲料至24孔培养板的孔底,每孔900 μL,拍打至液面平整,孔壁、孔口不粘结饲料,在室温自然凝结;
(2)将Bt毒素Cry1Ac用0.01M的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7.4)稀释成2μg/100μL;(3)待饲料冷却固定后,每孔加入100 μL的毒素溶液到饲料表面,室温下晾干后备用;
(4)在24孔培养板中每孔接入4-6头初孵棉铃虫幼虫,用保鲜膜包好后,再包两层尼龙纱覆盖防止试虫逃逸,置于恒温光照培养箱(26 ± 1℃,16L:8D,RH 60%)饲养,7天后检查结果;
(5)完全死亡或生长发育受到严重抑制(体重小于5 mg)的都作为死亡,幸存者留种后保存。
1.5 单对测交实验
(1)制备糖球,取适量棉花,用糖水浸湿后,搓成球状,放入底部钻孔的一次性杯中。
(2)用指形管从虫体头部套取当天羽化的棉铃虫成虫,以田间品系♀×SCD品系♂或田间品系♂×SCD品系♀的两种组合方式放入杯中,并盖上方块纱布,用皮筋固定。
(3)将杯子横放在不锈钢托盘中,纱布面朝外。
(4)贴上写有田间品系虫子雌雄区分及时间的标签,并编号,后放入交配室中培养。
(5)开始产卵后,每日将产卵的纱布换下放在11℃温箱内备用,并补充糖水。记录纱
布数量和日期。当纱布数量大于三张后,可以将纱布放置在26℃培养室中24h后,观察有效卵。
(6)卵孵化后,在准备好的移取有人工饲料的24孔培养板上,均匀喷上100 μL用0.01M的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7.4)稀释成2μg/100μL的Bt毒素Cry1Ac,自然晾干后,在24孔培养板中每孔接入1头初孵棉铃虫幼虫,每一家系使用两块24孔培养板,并用保鲜膜包好,后再包两层尼龙纱覆盖防止试虫逃逸,贴上标签后,置于恒温光照培养箱(26 ± 1℃,16L:8D,RH 60%)饲养,7天后检查结果,记录存活个数。
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