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TRIzol:购自南京聚雄华生物技术有限公司 (Invitrogen) ;
DEPC:购自南京寿德实验器材有限公司;
EB (10mg/mL) :购自南京寿德实验器材有限公司;
琼脂糖:购自BIOWEST公司;
DNA消解试剂盒:购自Thermo公司;
反转录试剂盒 (TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix) :购自北京全式金生物技术有限公司;
Phusion®超保真DNA聚合酶 (Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase) :购自NEB公司;
pEASY-Blunt Simple克隆载体:购自北京全式金生物技术有限公司;
琼脂糖凝胶回收试剂盒:购自GENRAY公司;
质粒小量制备试剂盒:购自GENRAY公司;
限制性内切酶SpeI, BamHI, NotI:购自NEB公司;
T4 DNA 连接酶:购自TAKARA公司;
DNA marker:购自GENRAY公司;
氯仿、异丙醇和无水乙醇;
50×TAE 缓冲液 (Tris, Na2•EDTA•2H2O, 乙酸) 。
1.2 实验方法
1.2.1 BnNRAMP基因家族筛选方法
利用Tair transpoter family获得NRAMP家族的Domain Accession,再借助SMART和Pfam网站获得这些结构域的hmm文件。之后,通过hmmer
软件
(v3.0),从TAIR和Brassica Datebase两个数据库中初筛得拟南芥中和油菜中含有结构域的蛋白基因,再经过MEGA软件(v5.0)去除冗余,并再次通过Pfam和SMART进行验证。最终所得基因序列经由clustalX和GENEDOC软件进行序列比对与进化树制作
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