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    pfu酶  0.5  10  ∞
    扩增出的两个片段用 GenClean  琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒(离心柱型)回收,按
    照以下程序进行PCR,使片段融合:
    表6 ALP609片段融合第一次PCR扩增反应体系及程序
    体系  使用量(µ L)  温度(℃)  时间
    双蒸水  15.1  94  5 min
    dNTPs  3  95             30 s
    10 × pcr buffer  2.5  55.7             30 s      10 个循环
    回收609-3’    1  72  2 min
    回收609-5’  1  12  ∞
    表7 ALP609片段融合第二次PCR扩增反应体系及程序
    体系  使用量(µ L)  温度(℃)  时间
    609-3’  1  94  5 min
    609-5’  1  95           30s
    pfu酶  0.5  55.7          30s      35个循环
        72  2 min
        72  10 min
    1.2.1.3  表达载体的构建
    ALP609片段融合后加 poly-A尾巴,体系:
    ALP609片段:10 µL
    Taq mix:25 µ L
    双蒸水:15 µL
    与T载体混合即可连接,转化至载体 E. coli DH 5α中,具体步骤如下:
    (1)  将E. coli DH 5α感受态细胞取出待其融化,在超净工作台中,将 10 µ L连接产
    物加入刚融化的100 µLE. coli DH 5α感受态细胞中,用移液枪轻柔吹吸混匀,充分混合
    后冰浴静置15 min。
    (2)  上述混合物 42℃水浴热激 60 s (不要超过 60 s)后,迅速放置在冰上冷却 1 min。 
    (3)  在超净工作台中向离心管中加入 890  µ L 不含氨苄的 LB 液体培养基,混匀后
    37℃,200 rpm 震荡培养 1 h,使菌体复苏。
    (4)  将复苏菌体 5000 rpm,离心3 min,舍去 750 µ L上清液,将剩余沉淀重悬为菌
    悬液,吸取100 µ L接种至含有氨苄的 LB固体培养基上,涂布均匀,静置 10 min 后放
    置于37℃温箱中倒置培养 8~12 h。
    挑取转化后的重组阳性菌落,于3 mL含终质量浓度为 50 mg/mL氨苄的 LB液体培
    养基,37℃培养6 h,取2 mL摇菌以通用引物 M 13 进行PCR 验证,取 1 mL送于相关
    机构测序鉴定。
    测序确定该片段为目的基因后将T载体双酶切获取ALP609基因的片段和双酶切的
    pET 28 a利用T4 连接酶连接转化至 E. coli DH5α中,再次片段双酶切初步验证目的基因是否连接到质粒上。再次将 ALP609片段和双酶切的pET  28 a利用 T4 连接酶转化到
    E. coli BL 21 中,获得的菌株称为 BL 609 菌株。转化具体步骤参见 T 载体的转化,但使
    用的培养基为含终质量浓度为 50 mg/mL卡那霉素的 LB液体培养基
    1.2.2螺原体黏附蛋白的原核表达与纯化
    1.2.2.1 重组质粒在大肠杆菌中的原核表达
    将BL 609 菌株接种于 1 mL含50 µg/mL卡那霉素的 LB液体培养基中,各接两管,
    37℃  180  rpm培养至 OD值为0.6~0.8,一管加入终浓度为1 mmol/L的 IPTG诱导蛋白
    表达,另一管加等量双蒸水做阴性对照。26℃诱导3 h,4℃,8000 rpm 离心5 min,收
    集菌体沉淀,加入70 µ L双蒸水混匀后煮沸 5 min,12%SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情
    况。
    SDS-PAGE电泳过程如下:
    (1)  上样体系10 µL:上述蛋白样品20 µL,Loading buffer 5 µL,煮沸 2 min,取 10
    µL进行电泳检测,电泳条件为稳压 120 V,电泳至蓝色染液行至电泳槽末端 1 cm 处。
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