(2) 取出玻璃板中的蛋白胶,用考马斯亮蓝染液进行染色,加热 20 s,重复3~5次。
(3) 染色完成后取出蛋白胶,至于脱色摇床上,加入脱色液进行脱色,直至蛋白条
带清晰。
1.2.2.2 重组蛋白纯化
将BL 609菌株按1%接种量接种于500 mL含50 µg/mL卡那霉素的LB液体培养基
中,37℃ 180 rpm培养至 OD值为0.6~0.8,加入终浓度为 1 mmol/L的 IPTG,26℃诱导
3 h, 4℃, 8000 rpm离心 10 min,上清液除净,称量细菌沉淀,按照 1 g 菌体/10 mL Binding
Buffer悬浮。充分混匀后的菌液经超声波裂解,超声 2 s,间隔3 s,超声 20 min,待裂
解液变得清亮,4℃,10000 rpm离心 40 min,12%SDS-PAGE电泳检测上清液和沉淀。
平衡:上下颠倒 NTA-Ni
2+
柱使其充分混匀,静置几分钟,柱内 20%的乙醇流尽后,
用4倍镍亲和树脂体积的 Bingding Bufffer 平衡柱子。
纯化条件的优化:NTA-Ni
2+
柱平衡后加入 10 µ L样品上清液,上样后分别用含有 20
mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L、300 mmol/L咪唑的Elution Buffer 洗涤,各浓度均洗
涤三管,每管2 mL,收集各浓度第一管和第三管的洗涤液,12%SDS-PAGE电泳检测。
检测结果只有单一条带的即为纯化最优浓度。
样品纯化:剩余样品全部加入平衡后的 NTA-Ni2+柱,用含有 300 mmol/L 咪唑的
Elution Buffer洗涤柱子,洗涤 6个柱体积,弃去初始流出的 2 mL洗涤液,收集其余柱
后液,12%SDS-PAGE 电泳检测。 NTA-Ni2+柱后续处理:待电泳检测确认最后一管样品无明显蛋白时,即可处理NTA-Ni2+
柱,方法如下:
(1) 300 mmol/L咪唑溶液洗涤 6倍柱体积;
(2) 0.5 mmol/L NaOH溶液洗涤 10倍柱体积;
(3) 双蒸水清洗 20倍柱体积;
(4) 20%乙醇溶液洗涤 10 倍柱体积,待乙醇全部流出后再加入 2 mL 20%乙醇溶液,
4℃保存。
1.2.3间接免疫荧光验证黏附蛋白的黏附性
将纯化的 ALP609 蛋白免疫宿主意蜂,检测 ALP609 蛋白在意蜂中肠的定位。
1.2.3.1蜜蜂中肠组织细胞分离培养
具体操作步骤:
(1) 整只意蜂在 2% NaClO 溶液中消毒 5~10 min;
(2) 置于Hank’s 溶液中润洗 2~3 min,润洗两次;
(3) 在Hank’s 溶液中分离出中肠,保持中肠完整性;
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