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    摘要：本试验为探寻一种快速的、便捷的以及低成本的载体，即通过在载体pXZP008上插入pCLEAN-G265的泛素启动子（Ubi-promoter），从而对pXZP008载体进行改造；利用水稻原生质体瞬时转化体系，将水稻OsAGO2、OsPRMT5基因分别连接到表达载体pXZP008-Ubi上，转入水稻原生质体中，并通过CO-IP验证蛋白OsAGO2和OsPRMT5是否存在互作关系。pXZP008-Ubi质粒的构建及应用为基因重组提供了一个快速有效的手段，也为验证其功能和蛋白互作方面的研究奠定了基础。26206
    毕业论文关键词：载体改造；pXZP008；CO-IP；OsAGO2；OsPRMT5
    An review on pXZP008 vector transformation and application
    Abstract：This experiment is to explore a fast, convenient and low cost carrier, namely by inserting pCLEAN-G265 in pXZP008 ubiquitin promoter (Ubi-promoter), and the transformation of the pXZP008 vector; transformation system using rice protoplast transient, rice OsAGO2, OsPRMT5 genes were cloned into expression vector pXZP008-Ubi and transformed into rice in the protoplast, and OsAGO2 and OsPRMT5 were verified the interaction by CO-IP. The construction and application of pXZP008-Ubi plasmid provides a rapid and effective method for gene recombination, and lays a foundation for the study of its function and protein interaction.
    Key words: vector transformation; pXZP008; CO-IP; OsAGO2; OsPRMT5
    目  录
    摘要    1
    关键词    1
    Abstract     1
    Keywords    1
    引言    1
    1  材料与仪器    2
    1.1实验材料    2
    1.1.1 植物    2
    1.1.2引物    2
    1.1.3质粒和菌株     2
    1.1.4培养基    3
    1.2主要仪器    3
    2.实验方法    3
    2.1 pXZP008载体的改造    3
    2.1.1 pCLEAN-G265的泛素启动子的克隆    3
    2.1.2 DNA的回收    3
    2.1.3 pXZP008和pCLEAN-G265载体连接     3
    2.1.4大肠杆菌JM109超级感受态细胞的制备    4
    2.1.5热激转化大肠杆菌    4
    2.1.6菌落PCR鉴定    4
    2.1.7 质粒提取    4
    2.1.8质粒测序    5
    2.2 pXZP008-Flag: OsAGO2载体的构建    5
    2.2.1 OsAGO2的克隆    5
    2.2.2 酶切与pXZP008载体连接    5
    2.3 pXZP008-HA:OsPRMT5载体的构建    6
    2.3.1 OsPRMT5的克隆    6
    2.3.2  酶切与pXZP008载体连接    6
    2.4 水稻原生质体的提取    7
    2.4.1水稻黄化苗的培养    7
    2.4.2 水稻原生质体的分离    7
    2.5蛋白表达    7
    2.5.1转化水稻原生质体    7
    2.5.2检测总蛋白    7
    2.6 CO-IP验证    7
    2.6.1 SDS-PAGE    7
    2.6.2转膜    8
    2.6.3免疫反应    8
    3．结果与分析    8
    3.1 pXZP008_Ubi克隆结果与分析    9
    3.2 pXZP008-Flag: OsAGO2的构建结果与验证    9
    3.3 pXZP008-HA:OsPRMT5的的构建结果与验证    10
    3.4 表达载体pXZP008-Flag: OsAGO2和 pXZP008-HA:OsPRMT5的构建结果与分析    10
    3.5 pXZP008-Flag: OsAGO2和 pXZP008-HA:OsPRMT5免疫反应的结果与分析    11
    4．讨论    11
    致谢    12
    参考文献    12
    关于pXZP008载体改造与应用
    引言：pXZP008载体是一种真核生物瞬时表达载体，这个载体上有一段多克隆位点(MCS)，而且这段多克隆位点有很常见的酶切位点。水稻OsAGO2为AGO蛋白家族的一种，AGO蛋白是一类高度保守的蛋白家族，具较高的亲水性[2]。在植物分生组织的文持以及生长时相转换的控制过程中均起重要作用[3-4]，且该蛋白在水稻花药、愈伤组织、小穗中均有表达[5]。OsPRMT5是水稻PRMT基因家族的基因，其在调控植物发育中有重要作用[6]。CO-IP是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法[7-8]。泛素(ubiquitin, Ub)是一种高度保守的小分子蛋白，由76个氨基酸组成，启动子是一种顺式作用(cis-acting)正调控元件，其强弱决定基因转录水平的高低，泛素启动子在增强基因表达的长期性，稳定性等方面有显著功效[9-12]。
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