菜单
　　

        为研究水稻蛋白OsAGO2和OsPRMT5是否存在互作关系，需要在载体pXZP008上插入pCLEAN-G265的泛素启动子(Ubi-promoter)，对pXZP008载体进行改造；再利用水稻原生质体瞬时转化体系，将水稻OsAGO2、OsPRMT5基因分别连接到表达载体pXZP008-Ubi上，转入水稻原生质体中。其中pXZP008-Ubi质粒的构建及应用为基因重组提供了一个快速有效的手段，有效提高了实验效率[1]。
      pXZP008载体结构图
    图1  pXZP008载体结构图
    1材料与仪器
    1.1实验材料
    1.1.1植物
    水稻日本晴
    1.1.2引物
    下划线处为酶切位点
    克隆pXZP008多克隆位点基因的特异引物：
    pXZP008-Ubi-F    CTGCAGTGCAGCGTGACCCGG
    pXZP008-Ubi-R    CTGCAGAAGTAACACCAAACAACAG
    克隆OsAGO2基因的特异引物：
    OsAGO2-pXZP008-Flag-F    CCCAAGCTTATGGACTACAAAGACGATGACGACAAAATC
    OsAGO2-pXZP008-Flag-R-stop    CTAGTCTAGATCAGATGAAGAACATGTTGTCCACCAG
    克隆OsPRMT5基因的特异引物：
    OsPRMT5- pXZP008-HA-Ubi -F    CCCAAGCTTATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACG
    OsPRMT5-pXZP008-HA-R-stop    TGCTCTAGATTATAGGCCGACCCAATATGATCGACC

    1.1.3质粒和菌株
    克隆载体pCLEAN-G265，克隆载体pXZP008，大肠杆菌JM109，农杆菌GV3101
    （1）主要抗生素：抗生素Ampicillin(20 ug/ml)，Kanamycin(Km，20 ug/ml)。
    （2）质粒DNA小量制备试剂盒（离心柱型）购置于杭州爱思进生物技术有限公司，PCR清洁回收试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒均购置于AXYGEN公司；引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；限制性内切酶，rTaq酶和T4-DNA连接酶为TaKaRa公司(Dalian, China)生产。
    1.1.4培养基
    LB培养基（1L）
    胰蛋白胨       10 g
     酵母提取物      5 g
    NaCl           10 g             固体再加入 1.5% 琼脂粉。
    1.2主要仪器
    PCR仪、小型高速离心机、水平式电泳仪、凝胶成像系统、电子天平、灭菌锅、恒温摇床、电热恒温水浴锅、低温冰箱、烘箱及微波炉。
    2研究方法
    2.1 pXZP008载体的改造
    2.1.1 pCLEAN-G265的泛素启动子的克隆
    以pCLEAN-G265 vector-Primer为模板，以pXZP008 MCS-F, pXZP008 MCS-R为引物，反应体系（共50 ul）如下
    （1）高保真PCR扩增PCR反应体系（50μl）如下：
    模板DNA    0.5 μl
    5×Ps Buffer    10 μl
    dNTP    4 μl
    Primer Star    0.5 μl
    引物F    1 μl
    引物R    1 μl
    灭菌蒸馏水    Up to 50 μl
    反应程序：98℃预变性5min；98℃变性10s，58℃退火5s，72℃延伸1min/1kb，运行30个循环；72℃ 5 min；4℃反应结束。
    （2）琼脂糖电泳检测：PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳，120V电泳20-30min，用0.5µg/ml溴化乙锭染色，在紫外灯下观察并用Bio-rad凝胶成像系统照相。
    2.1.2 DNA的回收
    琼脂糖凝胶回收DNA采用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒，具体步骤如下：
    (1）在紫外灯下切下目的DNA条带的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。称量胶块重量，计算胶块体积，以1mg=1μl计算胶的体积。
    (2）加入3个凝胶体积的Buffer DE-B，混合均匀。当分离的DNA片段小于400bp时，需再加入1个凝胶体积的异丙醇。
    (3）吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管，12000×g，离心1min。弃滤液。
    (4）将制备管置回2ml离心管，加500μl Buffer W1，12000×g，离心30s，弃滤液。
  1. 上一篇：土壤微生物及蚯蚓辅助松树修复Cr污染土壤的研究
  2. 下一篇：中国槌角蝗科剑角蝗科昆虫的泛生物地理学分析

  1. 植物表达载体的构建及转...

  2. 氧载体对纤维素酶发酵影响的初步研究

  3. 六六六降解关键基因LinB启...

  4. pET28a-GASBD3和pET28a -GASBD4原核表达载体的构建

  5. 位点特异性重组系统与高安全性载体的构建

  6. 植物表达载体的构建及马...

  7. 线粒体转录因子A超表达载体构建及鉴定

  8. 电站锅炉暖风器设计任务书

  9. 十二层带中心支撑钢结构...

  10. 大众媒体对公共政策制定的影响

  11. java+mysql车辆管理系统的设计+源代码

  12. 中考体育项目与体育教学合理结合的研究

  13. 河岸冲刷和泥沙淤积的监测国内外研究现状

  14. 当代大学生慈善意识研究+文献综述

  15. 乳业同业并购式全产业链...

  16. 杂拟谷盗体内共生菌沃尔...

  17. 酸性水汽提装置总汽提塔设计+CAD图纸

　　

About

751论文网手机版...

主页：http://www.751com.cn

关闭返回