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    1.2.3  外源GAs、ABA单因素处理
    配置浓度为0.10、0.25、0.50、1.00、2.00g/L的GAs溶液和浓度为0.025、0.05、0.10、0.25、0.50g/L的ABA溶液,用每个溶液浸泡经过预处理后两个品种的芹菜种子24h,蒸馏水冲洗三次后转入底部铺有两层吸水纸的一次性培养皿中,于15℃恒温培养箱中培养,设三次重复,探讨不同浓度的外源GAs和ABA溶液的分别作用对不同品种的芹菜种子休眠和萌发的影响。
    1.2.4  外源GAs和ABA协同处理    
    配置三种浓度(0.01、0.05、0.10g/L)的GAs与ABA溶液,以体积比分别为1:2、1:1和2:1的比例混合为9种溶液,分别浸泡经过预处理后的两个品种的芹菜种子24h,蒸馏水冲洗三次后转入底部铺有两层吸水纸的一次性培养皿中,于15℃恒温培养箱中培养,设三次重复,探讨不同浓度的外源GAs和ABA溶液协同作用对不同品种的芹菜种子休眠和萌发的影响。
    1.2.5  RNA的提取及cDNA的合成   
    采用Tiangen 公司的RNAsimple Total RNA Kit试剂盒,按步骤从‘津南实芹’的对照组(CK2)及经浓度为1.00g/L和2.00g/L的GAs溶液处理的25天苗中提取总RNA。之后用TaKaRa 公司的PrimeScript RT reagent Kit试剂盒将提取出来的三份总RNA反转录成cDNA,为了避免RNA中可能混有的DNA对实验结果造成干扰,需提前进行DNA消化实验。
    1.2.6  芹菜苗中α-淀粉酶基因的克隆    
    根据GenBank中拟南芥AtAMY设计出1对引物(AgAMYF1和AgAMYR1)。在Oligo软件界面,File菜单下,选择Open,定位到目的cDNA序列,在Tm窗口中,输入候选的上游引物序列位置。定位后,点击Tm窗口的Upper按钮,确定上游引物,同样方法定位下游引物位置,点击Lower按钮,确定下游引物。
    以cDNA第1链为模板进行扩增,PCR 反应条件设定为:94℃ 5 min;94℃ 30 s,54℃ 30 s,72℃ 60 s,共30个循环;72℃ 10 min。之后将获得的PCR产物经过1.5%的琼脂糖凝胶电泳观察拍照后,进行大片段胶回收。连接pMD18-T载体后,转化大肠杆菌DH5α,挑菌并进行菌液PCR鉴定之后开始摇菌,提取质粒,将得到的质粒送往南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。
    1.2.7  序列分析
    拟南芥、大麦等AMY基因的核苷酸序列来自于NCBI数据库。使用BLAST进行序列比对,蛋白质预测分析使用ffPred(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/),进化树分析使用MEGA 6。
    1.2.8  实时定量PCR反应
    采用ABI 7500 RealTime PCR System和7500 System software version 1.2.3进行实时定量PCR(Relative quantitative real-time RT-PCR)分析。将芹菜的actin基因作为参考,与目标基因一起进行扩增。根据基因序列设计引物,见表1。使用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex Taq 试剂盒进行实时定量PCR,按照试剂盒内操作步骤进行试验。相对定量使用比较CT法,诱导率等于2−ΔΔCT,ΔΔCT=(CT目标基因-CT actin)处理-(CT目标基因-CT actin)对照。
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