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摘要：豆科的模式植物——蒺藜苜蓿 (Medicago truncatula)目前是研究豆科植物和根瘤菌共生互作过程中信号调控的理想材料。植物中有一类特殊的小G蛋白ROP，其在囊泡的运输、信号的转导以及细胞的极性生长历程中起到了关键作用，而本文中的RIC家族是基于ROP的一种下游效应子。本研究通过建立高效的蒺藜苜蓿遗传转化体系，将RIC家族中的一个基因MtRIC8进行克隆及遗传转化，为进一步研究其在结瘤因子诱导的根毛变形过程中的功能以及研究豆科植物与根瘤菌共生互作信号调控机理奠定基础。实验结果综述为以下：(1)采用PCR技术扩增了RIC8基因，连接到pCAMBIA3301载体上构建了RIC8过表达载体；(2)通过侵染、共培养、诱导胚性愈伤及筛选、体胚发生等步骤获得了过表达植株；(3)对由第(2)步获得的植株进行PCR鉴定，结果表明遗传转化是成功的。26573
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毕业论文关键词：蒺藜苜蓿、RIC8、转基因
Cloning and overexpression of MtRIC8 gene of Medicago truncatula
Abstract：As leguminous model plant，Medicago truncatula is an ideal material to explore signal control of symbiotic interactions mechanism between Leguminous plants and Rhizoid. ROPs are special small G proteins in plant, which significantly affect vesicle transport, signal transduction and polar growth of cell. RICs are the downstream effectors of ROP. This study established efficient Medicago truncatula genetic transformation system, cloning and genetic transformation MtRIC8 gene from the RIC family, laying a foundation for studying its function in the process of nodular factor induced-root hair deformation and signal regulation mechanism of the symbiotic interactions. The experimental results are following:(1) Using PCR amplified the RIC8 gene and linked it to the pCAMBIA3301 vector, building the expression vector; (2) Through infection, cocultivation, embryogenic callus induction, screening and somatic embryogenesis, we obtain the plant of gene overexpression; (3) Identified those plant by PCR, results show that the genetic transformation is successful.
Key words: Medicago truncatula, RIC8, genetic transformation
目 录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
1 绪论1
1.1根瘤共生的过程2
1.2 ROP家族基因3
1.2.1 ROP家族简介3
1.2.2 RIC家族简介4
1.3 蒺藜苜蓿的遗传转化5
1.4 研究的目的和意义5
2 材料与方法6
2.1 材料6
2.1.1植物材料6
2.1.2 克隆载体与菌株6
2.1.3 工具酶、抗生素及常用试剂6
2.1.4 培养基6
2.1.5 主要仪器和设备7
2.2 方法7
2.2.1 蒺藜苜蓿RNA的提取7
2.2.2 mRNA的反转录7
2.2.3 PCR扩增目的基因片段并回收8
2.2.4 目的基因转化载体并连接大肠杆菌8
2.2.5 质粒的提取8
2.2.6 质粒转化农杆菌8
2.2.7 转基因植株的获得8
2.2.8 植株DNA的提取鉴定9
3 结果与分析9
3.1 MtRIC8过表达载体的构建9
3.2 蒺藜苜蓿RIC8过表达植株的获得10
3.3 转基因植株的PCR检测11
4 讨论12
致谢12
参考文献12
蒺藜苜蓿MtRIC8基因的克隆及过量表达
1 绪论
现今我国的环境问题日渐严峻，水资源分布不均匀，水土流失严重，荒漠化面积扩大，草地退化面积增加，物种多样性严重损坏。氮元素是构成生命的基本元素之一，虽然空气中有大量的氮气，但是化肥工业上只有在高温高压条件 (470-520 °C，2.03×107-5.07×107 Pa) 下气态氮才得以转化为肥料氮，而自然界中豆科植物在常温常压条件下与根瘤菌共生即可固定氮气[1]。因此，豆科植物共生固氮成本低廉且较为环保和节省资源。作为一种农作物，豆科植物可以作为人类食物中植物蛋白的重要来源以及作为绿肥来提高土壤肥力，且该类植物根部通过与固氮微生物共生能够直接转化氮气为生物可利用的氨。研究表明，生物圈中的生物固氮量有80%是来源于豆科植物和根瘤菌的共生固氮[2] ，现代农业中豆科植物的共生固氮是解决土壤养分缺失，避免过量氮肥污染的重要渠道。在此过程中，大量的信号交流发生在宿主植物和根瘤菌之间，它们相互交叉、相互衔接，形成一个庞大的信号调节网络[3]，植物小G蛋白ROP是其重要的信号调节分子之一。