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    PT1200DL手持式电动组织匀浆机(瑞士宝创(Polytron)公司);GMBh8 CO.KG Miklro-22R高速低温离心机(德国Andreas Hettich公司);Q5PCR仪(美国Bio-Rad公司);核酸浓度测量仪(德国Eppndorf 公司);BS210S电子分析天平(北京赛多利斯天平有限公司)。
    1.2  试验动物及样品采集
    3日龄雄性仔猪、90日龄雄性生长猪及120日龄雄性成年梅山猪各2头,由江苏禾木农博园有限公司梅花山猪场提供。
    致昏后采用心脏放血法处死,并迅速采集十二指肠、空肠(前段、中段和后段各采3份)、回肠等小肠组织各3份。经生理盐水漂洗后超低温保存。
    1.3  引物设计与合成
    根据GenBank上公布的猪的ACE2和GAPDH的基因序列,用Primer Premier 5.0软件设计引物(序列见表1),并由北京鼎国昌盛生物技术有限公司合成。
    表1  ACE2和GAPDH引物序列
    Table 1  the primer sequence of ACE2 and GAPDH
    基因    基因库序列号    引物序列(5'-3')    产物大小/ bp
    ACE2    NM_ 001123070.1    GAGAAACCGAGCATAGAT    106
            AGGGAGACCAATAGACAC    
    GAPDH    XM_ 007469428.1    CACCAGGGCTGCTTT    203
            TGATGTTGGCGGGAT    

    1.4  肠道各组织总RNA提取和反转录
    取约100mg猪小肠各组织,用电动匀浆器彻底匀浆后采用Trizol抽提法提取总RNA。采用紫外比色法测定总RNA的浓度和纯度后使用甲醛变性胶验证其完整性。选取A260/A280在1.8~2.0之间的总RNA,两步法进行反转录,得到cDNA。反转录体系如下:RNA 2μg,RNA酶抑制剂 20U,M-MLV反转录酶 100U,5×RT buffer 5μL,dNTP 0.14mmol/L,随机引物 4μmol/L。
    1.5  ACE2的PCR扩增及电泳鉴定
    以上述cDNA为模板进行RT-PCR扩增,条件如下:95℃预变性 5min;95℃变性 30s,53℃退火 30s,72℃延伸 1min,共计36个循环。1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增后产物,电压为115V,时间为45min。
    1.6  不同日龄仔猪胃肠道各组织ACE2 Real-time PCR定量鉴定
    对上述cDNA进一步采用Real Time PCR 荧光染料掺入法(Sybr-Green)进行ACE2的相对定量分析。20μL定量反应体系中,荧光酶SYBR Green 10μL,10pmol/μL基因引物2μL,cDNA模板2μL,灭菌水6μL。以溶解曲线不出现非特异性峰,最高的荧光值和最小的Ct值为标准,分别优化退火温度、循环条件和引物浓度。PCR反应条件为:94℃预变性 5min;95℃变性 30s,60℃退火 30s,72℃延伸 15s,共计40个循环。每个样品做2个重复。循环结束后,绘制溶解曲线,并验证产物纯度。各样本结果均用其相应的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GADPH)标化,用相对定量2-△△CT法进行数据统计。
    1.7  统计学分析和处理
    使用SPSS 16.0统计软件进行统计分析和处理,差异显著性检验采用独立样本t检验(Student's t Test)和单因素方差分析(One-Way Anova, LSD)。所有试验数据均以平均值±标准误(χ±SE)表示。
    2  结果与分析
    2.1  不同日龄猪肠道中 ACE2 基因的 RT-PCR
    将ACE2基因RT-PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳验证,结果如图1、图2和图3所示。结果显示:ACE2基因在3日龄仔猪、90日龄生长猪和120日龄成年猪的各自十二指肠、空肠(含前段、中段及后段)和回肠中均有106 bp左右的清晰条带,因此表明ACE2在这些肠道内均有表达。
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