2017年3月上旬,将花盆移入不同遮光强度的大棚。大棚规格为3 m×4.5 m,设两种遮荫梯度,采用TES-1339照度计测定其光强,一层遮阳网为全光照的(46.3±1.8)%,记为L1,二层遮阳网为全光照的(28.5±0.7)%,记为L2,未遮阴大棚光强为对照,记为L0。叶面喷施6种不同处理,分别为0.1mmol•L-1SNP,2.5mmol•L-1钨酸钠,0.1mmol•L-1cPDIO,5mg•L-1ABA,2.5mmol•L-1钨酸钠+0.1mmol•L-1cPDIO, 0.1mmol•L-1SNP+5 mg•L-1ABA,L0及各遮阴棚中植株的叶片喷施相同体积的蒸馏水作为对照(CK)。每种处理设置4个重复,每隔1天喷施一次,总共喷施3次,每次500 ml。
1.3 参数测定
1.3.1 植物根茎叶和叶面积的测定
2017年4月下旬,不同的外源物质处理30天后,每种处理中在每个花盆中随机选取3个植株。各植株根、茎、叶分开。叶片用JC503-AM-300叶面积仪进行测定叶面积后,与根、茎分别在105℃下杀青45 min,65℃烘干至恒重,称重。
1.3.2 叶片光合特性的测定
2017年4月下旬,不同的外源物质处理15天后,每个花盆选择东、西、南、北四个方向的中上部成熟叶片各1片,连续三天,用LI-6400便携式光合仪(美国LI-COR公司)测定其光合特性。设置叶温25℃,流量500μmol•s-1,使用红蓝光源,光强1000μmol(m•s)-1,采用CO2提供氧气。待读数稳定后,记录所示数据,每片待测叶重复三次,取其平均值。测定的光合参数包括:净光合速率(Pn)、胞间CO2浓度(Ci)、气孔导度(Gs)以及蒸腾速率(Tr)。羧化效率(CE)由Pn/Ci估算。
1.3.3 叶片超显微结构的测定
2017年3月下旬,不同的外源物质处理15天后,随机切取主茎顶部第3-4片完全展开叶叶片中部主脉两侧1-2 mm见方小块,先用2%戊二醇前固定4小时,再用0.1mmol•L-1磷酸缓冲液(pH7.2)冲洗3次,2%锇酸后固定,乙醇-丙醇梯度脱水后,使用Epon-812环氧树脂进行包埋,LKB-5超薄切片机切片,醋酸铀-柠檬酸铅双重染色,采用JEM-1200EX型透射电镜(JEOL,Tokyo,Japan)观察切片。
1.3.4 Rubisco酶活性的测定
2017年3月下旬,不同的外源物质处理15天后,随机取主茎顶部第3-4片完全展开叶的叶片0.05g.置研钵中加液氮固定并迅速磨成粉状,加入1ml Rubisco预冷抽提液(含50mmol•L-1Tris-HCl pH7.5)1mmol•L-1,10mmol•L-1MgCl2、12.5%(V/V)甘油,1%(W/V)可溶性PVP,使用前加0.1%β-巯基乙醇)。使用匀浆器,磨成均浆30s,停30s,交替三次。汲取此均浆1ml在15000g高速离心15min,整个过程应在0~4℃下进行,上清液即为酶粗提液。0℃保存,备用。
初始活力的测定:取100μl•ml-1酶粗提液迅速加入到900μl ml-1达到测定温度的测定液(含Hepes50mmol•L-1(pH值8.0)EDTA 1mmol•L-1, MgCl2 20mmol•L-1,DTT(二硫苏糖醇)2.5mmol•L-1, NaHC03 1mmol•L-1, ATP 5mmol•L-1,磷酸肌酸5mmol•L-1,NADH 20.15mmol•L-1、磷酸肌酸激酶10 U• ml-1、甘油醛-3一磷酸脱氢酶10 U• ml-1,磷酸甘油酸激酶10 U •ml-1, RuBP0.6mmol•L-1),摇匀,倒入比色杯,以蒸馏水作为空白,作为零点值并开始读数,每隔5s记录340nmOD值至30s为止。此过程在28℃下进行。
总活性的测定:取100μl酶粗提液,加人到装有200μl•ml-1酶活化反应液的比色杯中(最终浓度中各成分的含量为:33mmol•L-1Tris-HCI (pH7.5),0.67mmol•L-1EDTA,33mmol•L-1MgCl2,10mmol•L-1NaHC03)温度为28℃,活化10 min后迅速加入28℃温育的700μl。总活力分析测定液,最终浓度中各成分与Rubisco初始活力测定相同,并按初始活力的相同的方法读数。Rubisco的活化状态由初始活力与总活力的比值求得,叶片酶粗提液中Rubisco活力的测定必须在粗提液抽提后30 min内完成。
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