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2.1.2.1 酵母异源功能互补实验 7
2.1.2.2 酵母生长曲线测定实验 8
2.2 镉处理玉米韧皮部蛋白的鉴定 9
3 讨论 10
致谢 10
参考文献 11
拟南芥耐镉基因的鉴定和玉米韧皮部蛋白的提取
引言
镉（Cd）是一种有毒的重金属污染物，通过农业药剂、工业生产排放的废水废物以及含镉的肥料的使用进入农业生产系统[1]，对植物具有明显的毒害作用,土壤中的Cd污染导致作物产量降低,同时镉元素积累经食物链的层层富集最终进入人体，危害人类健康[2]。镉离子十分容易被植物的根系吸收[3]。许多植物的金属胁迫机理等有共性的问题可以通过 Cd2+研究来说明。镉对植物体产生毒害作用主要是破坏信号传递系统, 使得某些酶的转录被激活。当镉的毒害作用达到一定程度,植物体就会表现出生长缓慢、植株矮小等中毒症状,严重影响作物产量[4]。
拟南芥是遗传学和植物发育学重要的模式生物。研究发现真核生物中，大多数的VPS蛋白会集结形成4个多亚基复合体，在生物的膜泡转运生物学过程中发挥重要作用[5]。这四种复合体分别为逆转运输复合体、HOPS/CORVET复合体、GARP复合体、核内分选转运复合体系统（ESCRT）。有实验表明，使用蔗糖和黑暗处理来控制拟南芥碳源的方法验证拟南芥VPS25在碳饥饿状态下引起自噬过程的发生，并且研究发现拟南芥VPS25会响应生长素的胁迫。在拟南芥中用RNA干扰有效减少了VPS4的直系同源基因At SKD1的表达，拟南芥的抗盐能力下降，说明VPS4响应了拟南芥盐胁迫，同时发现ESCRT复合体系统参与植物对逆境胁迫的响应[6]。在以胡杨为研究对象的实验中，对胡杨进行盐胁迫处理后，受盐信号的诱导，PeVps37-1与Pe Vps37-2两个基因表达，所以，我们有理由相信PeVps37-1与Pe Vps37-2与植物抗盐能力有关，并通过模式植物拟南芥为遗传转化材料，在盐胁迫下，验证了Pe Vps37-2有更强的耐盐能力，说明其较快的进化效率，受到正选择。Vps37对真菌胁迫也有一定响应作用。当受到真菌、病毒等物质的侵害时，植物的免疫系统会释放激素信号来抵御侵害。
有研究表明，在重金属胁迫作用下，酿酒酵母可以对其解毒。首先，酵母中的CUP1基因可以表达金属硫蛋白，金属硫蛋白可以与重金属离子发生结合，从而解除金属的毒性。其次，在重金属胁迫作用下CUP2/ACE1会激活特定的基因，这些蛋白经过转录翻译后可以结合重金属离子，以此达到解毒作用。这是由于酿酒酵母中的跨膜蛋白 BSD1、Δycf1 和 COT1 可以作为离子泵产生作用，将酵母细胞中的重金属离子转运到液泡中进行封存，达到解毒目的。最后蛋白质的泛素化相关的蛋白质-泛素结合酶通过蛋白水解对重金属离子解毒[7]。
突变株Δycf1对镉超敏感，利用目的基因克隆在酵母表达载体上构建拟南芥cDNA文库，以空载为对照，当文库转化酵母镉敏感突变株Δycf1表达后，使含有外源蛋白的酵母突变株在含镉的培养基上正常生长，验证拟南芥VPS29基因是否耐镉。本文前段阐述了利用酵母异源互补实验验证拟南芥VPS基因的耐镉性。
玉米是C4植物，对多种的胁迫均表现出比较好的抗性，生长迅速，生物量大，在植物修复方面具有可观的应用潜力，是广泛用于重金属胁迫研究的重要农作物[6]。近几年来，对镉胁迫对玉米种子萌发、幼苗抗氧化酶系统及光合作用影响的研究已经取得了很大成就，极大地促进了镉胁迫玉米蛋白组的研究。
韧皮部既是传递同化产物的器官，还是传递植物生长和发育信息的通道。大量研究表明，筛管作为韧皮部的基本组成部分，不仅可以运输小分子营养物质，而且可以运输信号分子和大分子，如蛋白质、mRNA和一些小RNA（如siRNA和miRNA）[8]。近年来，研究发现韧皮部内的蛋白和RNA等大分子物质作为信号物质，介导了植物系统生长与发育的调控[9]。植物韧皮部中的蛋白质可以分为几类，其中一种是结构性蛋白，其中含量最多的两个蛋白是PP1和PP2。这两种蛋白可能定位在细胞质，参与长距离运输，在胁迫和病原菌反应中发挥作用。主要表现为当韧皮部受到一定伤害时，PP1和PP2能够及时阻塞筛管来避免伤害[10]。第二种是抗氧化和胁迫响应蛋白，这些蛋白酶类可能在植物逆境胁迫下及时的清除自由基，同时还存在大量蛋白酶抑制剂，抵御韧皮部受到昆虫或者病毒的侵害[11-12]。韧皮部蛋白的种类还包括蛋白合成代谢相关蛋白、泛素介导的蛋白水解相关蛋白、RNA结合蛋白和开花等发育过程相关蛋白。对各种植物的韧皮部的研究表明植物韧皮部不仅在生长发育方面发挥了重要的调节作用，而且植物文管系统对于响应环境逆变化起着举足轻重的作用。本文后段阐述了利用凝胶的SDS-PAGE电泳技术检测镉处理玉米韧皮部差异蛋白，为减轻或克服镉逆境对玉米生产的危害提供指导意义。