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摘要：由根癌农杆菌介导的 T-DNA 插入转基因技术，是产生转基因植物的最广泛使用的手段之一。但插入的 T-DNA 片段常发生基因沉默的现象，这阻碍了这一技术安全有效的应用。而 DNA甲基化是引起基因沉默的一种主要方式,是调节基因组功能的重要表观遗传方式。已有研究发现在玉米中T-DNA 插入突变体与 DNA 甲基化增加相关，并且最近在拟南芥中也发现这一现象，但这种甲基化的生物学作用机理尚不明确。 本文以 RNA介导的DNA甲基化途径中的一个控制甲基化水平的蛋白 NRPD1的 nrpd1-3 基因T-DNA 插入突变体材料为研究对象。通过甲基化测序发现其 T-DNA 插入位点周围的DNA 甲基化水平升高。应用 T-DNA 插入方式及数量分析、遗传学分析和甲基化水平分析等一系列方法，初步探索 T-DNA插入引起 DNA 甲基化上升的分子机理。研究发现 SUVH、CMT2、CMT3、DRM2蛋白可能参与到了介导 nrpd1-3 T-DNA 插入位点附近的 DNA甲基化。27448
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毕业论文关键词：T-DNA 插入；拟南芥；DNA甲基化；基因沉默
The preliminary mechanism research of DNA methylationdirected by T-DNA insertion
Abstract： Transformation of plants mediated by the microbe Agrobacterium tumefaciens is one of the mostwidely used means of generating transgenic plants.However, the insertion of T-DNA fragments oftenoccurs gene silencing phenomenon, which hindered the safe and effective application of thistechnology.DNA methylation is a major reason of gene silencing, and is an important way to regulategenomic function.Such epimutants have been found to be correlated with increased DNA methylation inmaize and very recently in Arabidopsis. But the biological mechanism of methylation directed by T-DNAinsertion is not clear. In this paper, T-DNA insertion mutant material nrpd1-3 was used to the study.Methylation sequencing revealed elevated levels of DNA methylation around the insertion site.Themolecular mechanism of DNA methylation induced by T-DNA insertion was explored by T-DNA insertionmethod and quantitative analysis, genetic analysis and methylation level analysis.The research result showsSUVH、CTM2、CMT3、DRM2 protein maybe direct the DNA methylation in nrpd1-3 T-DNA insertionlocus.Key words: T-DNA insertion; Arabidopsis; DNA methylation; gene silencing
目 录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1 材料与方法3
1.1 实验材料 3
1.2 实验方法 3
1.2.1 拟南芥材料的种植 3
1.2.2 拟南芥材料的杂交3
1.2.3 转基因植株的 DNA 抽提 4
1.2.4PCR 检测的目的基因4
1.2.5 T-DNA 插入方式分析4
1.2.6 DNA 甲基化测序 5
2 结果与分析6
2.1 nrpd1-3 突变位点附近的甲基化水平升高 6
2.2 获得杂交材料 5
2.3 纯合多突变体的筛选及甲基化测序 5
2．3．1 纯合多突变体材料的筛选 7
2．3．2 纯合多突变体的甲基化测序9
2.4 T-DNA 插入方式分析10
3 讨论11
3． 1 介导该位点甲基化水平升高的蛋白的功能11
3.1.1 CMT 蛋白的功能11
3.1.2 DRM2 蛋白的功能11
3.1.3 SUVH 蛋白的功能11
3．2 T-DNA 插入与基因沉默11
致谢12
参考文献13
图 1 T-DNA 插入检测引物设计示意图5
图 2 nrpd1-3 与 Col-0 甲基化测序结果对比图5
图 3 PCR 鉴定原理示意图 5
图4带型示意图 7
图 5 met1-1 酶切带型示意图9
图 6 甲基化水平下降对比图10
图 7 T-DNA 旁侧插入情况10
图 8 T-DNA 旁侧插入情况示意图11
表 1 nrpd1-3 与 Col-0 甲基化测序结果对比表6
表 2 PCR 检测引物表8
引言T-DNA是根癌农杆菌Ti 质粒上的一段DNA序列,能够有效地插入整合到植物细胞基因组当中，长度大约为 20kb,插入部分能够稳定地遗传表达。T-DNA 在植物中的插入拷贝数通常较低,大多数为单拷贝插入。整合到植物基因组中的单拷贝 T-DNA 会依据孟德尔遗传特性,在以后世代中长期稳定地表达。并且插入后不再移动,便于保存和利用[1]。T-DNA 大多在插入的基因类型上没有明显偏向性，但更偏向于插入到染色体中的基因丰富且转录活性高的部位,以及基因的非翻译区和启动子区域 [2]。而在重复区的插入频率较低。已有研究验证了 T-DNA 的插入频率在染色体末端较高,而在着丝点附近较低这一现象。由于插入的 T-DNA 序列是已知的,可以利用反向 PCR、TAIL-PCR、质粒挽救等技术对已突变的基因进行克隆及序列分析,并且还可以根据突变体的表型差异来推测其突变基因的功能。而且还能够利用扩增出的插入位点附近的侧翼序列,对基因进行更全面的功能分析。 由此可见,T-DNA 插入技术已成为发现新基因及鉴定基因功能的一种重要的和广泛使用的手段[3-4]。根癌农杆菌是一种革兰氏阴性的土壤病原细菌,其中携带有天然转基因功能即能够将其部分遗传物质插入到寄主植物的基因组中的 Ti 质粒或 Ri 质粒,并且插入的遗传物质能够稳定地遗传和表达,赋予了植物新的基因组成。农杆菌侵染植物时,菌体并不直接进入寄主植物细胞内,只是把Ti或Ri质粒的DNA片段导入到了植物细胞的基因组中。Ti 质粒或 Ri 质粒是理想的基因克隆和转基因载体[1]。T-DNA 是 Ti 质粒上的 DNA 片段,它包含着三个重要的基因,当整合到宿主细胞时将分别诱发opine化合物的合成,瘤以及抑制细胞分化。Ti 质粒自身具有很多优点,很适合作为导入外源基因的载体。而外基因就是通过整合到 T-DNA 上,进入寄主细胞内的。转基因沉默( transgene silencing)现象,又称为转基因失活现象。即向生物体内导入的外源基因,引起了外源及其同源的内源基因不表达或不完全表达的现象。通常转基因沉默现象只发生在转基因和与其同源的内源基因之间,不会影响其他基因的表达。转基因插入的 T-DNA 片段常发生基因沉默的现象，这阻碍了这一技术安全有效的应用。转基因沉默现象分为 2 类:一类是转录水平上的基因沉默( TGS),另一类转录后水平上的基因沉默(PTGS)。转录水平的基因沉默是由于某种原因造成了启动子失活 ,使 mRNA 不能正常合成,最后导致基因失活不能正常表达。另外，由位置效应引起的基因沉默现在也被归类到了转录水平上的基因沉默。转录后水平上的基因沉默是由于转录产生的 mRNA被降解,而导致基因不能正常表达 [5]。已有的研究结果发现,几乎所有转录水平的转基因沉默都与转基因启动子的 DNA 甲基化有关。DNA 甲基化指 DNA 序列中的胞嘧啶(C)碱基在甲基化转移酶的催化下与甲基发生共价结合的表观遗传现象。DNA 甲基化可在细胞分裂过程中传递给子细胞的。早有研究发现，胞嘧啶在 CG 位点上的甲基化可做为遗传学标记,并且这种甲基化能通过动物的体细胞的分裂而遗传下去。在植物和哺乳动物中，胞嘧啶残基第 5 位碳原子上的甲基化现象是目前研究最为广泛的表观遗传修饰现象。在动物中, 胞嘧啶的甲基化多存在于 CG序列上;而在植物中，除了 CG 甲基化外, 还存在 CHG 和 CHH 两种甲基化类型(H = A, C或 T)。拟南芥中 CG、 CHG 和 CHH 的甲基化程度大致分别为 24%、 6.7%和 1.7%[6]。DNA 甲基化调控基因表达的机制主要可能有以下儿种:1) DNA 甲基化可以直接干扰转录因子与其识别位点的结合,进而影响基因转录的正常进行。 2) 一些甲基化 DNA 结合蛋白如:MeCPl 和 MeCP2 及 MBDs (Methylated DNA-binding domain)等可以特异性的结合到甲基化的胞嘧啶位点上,并且通过招募组蛋白去乙酰化酶(HDAC)来形成竞争性转录阻遏物来竞争性的抑制转录因子的结合。 3)还有一种比较常见的调节方式是,DNA 序列上的一些胞嘧啶位点被甲基化修饰以后,可以通过电荷间的相互作用而影响组蛋白甲基化或乙酰化修饰水平的改变,通过调整染色质构象来影响转录因子与基因的结合调控实现的[7]。DNA 甲基转移酶( DNA methyltransferase) 是 DNA 甲基化过程中的关键酶,在调节基因的甲基化水平的过程中起着举足轻重的作用。植物中至少有 3 类 DNA 甲基转移酶 , 主要包括 MET1( methyltransferase)家族、CMT( chromomethy lase)家族和 DRM( domains rearranged methyltransferase)家族[7]。甲基化测序原理为 ：DNA 在经过Bisulfite(亚硫酸氢钠)处理后,C 碱基若已发生甲基化则序列保持不变；若未发生甲基化,则胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U)。经巢式 PCR 扩增后变成胸腺嘧啶(T)[8]。然后采用边合成边测序的方式,根据不同的荧光信号信息确认碱基种类,经多次循环后,获得完整核酸序列。得到测序结果之后,采用 Bismark 法进行甲基化位点检测[9]。首先去掉 PCR 产生的 sibling。然后根据参考基因组序列比对甲基化位点,若原 C 位点比对上的碱基是C,则发生了甲基化;若是 T,则未发生甲基化。全基因组甲基化测序(Whole Genome BS-Seq, WGBS)技术是将重亚硫酸氢盐处理方法和高通量测序技术相结合的一种新型测序技术。它相当于在全基因组范围内利用亚硫酸氢盐修饰后，再用测序法进行检测。它可以对具有参考基因组信息的物种实现全基因组单碱基的甲基化检测[10]。可直接读取 C 碱基是否被甲基化,以实现单碱基分辨的甲基化分析,覆盖了全基因组范围内每一个 C 碱基。因此，全基因组甲基化测序因单碱基分辨率高,覆盖范围广等优势而被广泛应用。本课题以就是以 RNA 介导的 DNA 甲基化途径（RDDM pathway）中 NRPD1 的 T-DNA插入突变体材料为研究对象，对突变体进行全基因组甲基化测序并与野生型哥伦比亚（Col-0）材料的测序结果进行对比，发现 nrpd1-3 突变体材料 T-DNA 插入位点附近的CHG 和 CHH 甲基化水平显著升高。由此引发本课题，通过应用 T-DNA 插入方式及数量分析、 遗传学分析和甲基化水平分析等一系列遗传分析方法， 初步探索nrpd1-3 位点 T-DNA插入引起 DNA 甲基化上升的分子机理。1 材料与方法1．1 实验材料本实验中的突变体材料是以野生型拟南芥：哥伦比亚（columbia-0）为受体,经过农杆菌介导而产生的 T-DNA 插入阳性转基因植株群体。突变体材料有nrpd1-3、cmt3-11、cmt2-7、suvh4/5/6、drm2-2、drm1-2 等,由公司直接购买。1．2 实验方法1.2.1 拟南芥材料的种植拟南芥(Arabidopsis thaliana)又称之为鼠耳芥,十字花科拟南芥属。由于具有生育期短、个体小及基因组小并且已经完成了全基因组测序等特点,长期以来被作为分子生物学研究的模式作物之一[11]。实验材料的种植采用移栽法：种子表面用次氯酸钠消毒后播于 MS 无菌培养基上，在 4℃冰箱春化两天后取出进行光照培养， 1 周半后将苗移栽到培养土和蛭石按体积比1:1混合的培养介质中， 用塑料保鲜膜将盆表面覆盖以保持湿度， 使幼苗适应新环境2-3d后将膜取下。在 空气湿度为 65%、温度 22℃的人工光照（白色荧光灯，16 h 光照，8 h黑暗，光照强度为 63 mE.s-1.m-2)的温室中培养[12]，待开花后进行杂交。1.2.2 拟南芥材料的杂交（1）选取目标母本植株未开放的花，用镊子将周围多余的花蕾夹除，只保留最好的花蕾 5 个左右；（2）将花蕾至于在解剖镜视野的中央，用消毒后的镊子拨散花苞，拔去花萼和花瓣，接着把淡黄色的雄蕊（共 6 个）完全夹掉，只留下一个柱头，套袋处理，以免受到污染；（3）选择对应目标植株已完全开放的花作为父本，于次日上午10点左右用镊子摘取花药，将花粉轻轻涂抹在母本的柱头上，并做标记；（4）3d 后若柱头伸长，则表示杂交成功。杂交成功后，30d左右后收集杂交种子，并干燥保存。1.2.3 转基因植株的 DNA 抽提植株叶片的 DNA 抽提采用 CTAB 法[13],详细的实验步骤如下:（1）取 3cm 左右长的拟南芥新鲜叶片,放入 1.5ml 的 Eppendorf 离心管中，加小钢珠于液氮中冷冻 5min，然后置于2000 型 GENo/GRINDER 仪器上自动粉碎样品 1min；（2）加入 600ulCTAB 提取液,56℃温育 30min,过程中颠倒数次；（3）加入 600ul 氛仿，轻缓颠倒均匀，8500r/min 室温离心10min；（4）吸上清400ul于另一离心管中,加入等体积的异丙醇,混匀后置于-20℃冰箱中30min 以上,12000r/min 离心 5min；（5）倒掉上清液后再用 75%乙醇浸洗沉淀,12000r/min 离心 5min，倒掉上清液后自然风干；（6）DNA 沉淀溶于 100ul 无菌水中,每次取 2ul 做 PCR。