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摘要:小分子RNA是一类20-25nt左右的非编码的RNA，通常在转录后水平抑制基因表达。本研究利用已经公开的水稻不同组织的small RNA高通量测序数据，在水稻种子中鉴定了27个特异表达的miRNA，2162个差异表达的sRNA。通过基于降解组的验证方法，构建了水稻种子特异的small RNA调控网络。本文通过对水稻种子特异表达的sRNA进行基因表达调控网络的构建，为进一步解析small RNA在水稻种子发育过程中的调控机制奠定了基础。 27449
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毕业论文关键词：Small RNA；高通量测序；调控网络；种子发育
Comprehensive Analysis of Seed-Specific Small RNA Regulatory Networks in Rice
Abstract: The non-coding small RNAs play important roles in plant growth and development usually by repressing expression of target mRNAs. By using the small RNA sequencing data in public, we systemically investigated root, seedling, shoot, leaf, inflorescence, panicle and seed small RNAs in rice A total of 27 seed-specific microRNAs and 2162 sRNAs were identified. Through degradome-based small RNA-target predictions, we constructed seed-specific small RNA regulatory networks in rice. This work provides a detailed analysis of seed-specific small RNAs and a basis of understanding the small RNA mediated gene expression regulatory mechanisms in rice seeds. Key words: Small RNA; High-throughput sequencing; Regulatory network; Seed development
目 录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1 材料与方法4
1.1 高通量测序数据来源 4
1.2 miRNA定量分析5
1.3 miRNA和 sRNA 在不同组织中的差异表达分析5
1.4 miRNA和 sRNA 的靶基因预测和降解组验证5
2 结果与分析5
2.1 高通量测序数据的分析5
2.2 miRNA定量分析6
2.3 差异表达小 RNA 的鉴定7
2.4 miRNA和 sRNA 的降解组验证和构建基因调节网络8
3 讨论11
致谢12
参考文献12
小RNA（small RNA）是一类长约20-25nt的非编码RNA分子，并在高等和低等生物中广泛存在。真核生物中的小RNA可以分为：miRNA、siRNA(Small interfering RNA)、tasiRNA(Trans-acting siRNA)、natsiRNA(Natural antisense transcript-derived siRNA)和piRNA(Piwi-interacting RNA)[1]。 miRNA(简称miRNA)是一类正常转录的不编码蛋白质的内源小分子RNA，主要通过与靶基因mRNA结合，在转录后水平上调节靶基因的表达，是真核生物基因转录过程的重要调控因子[2-3]。自从miRNA最初于1993年在秀丽隐杆线虫中被发现[4-5]以来，在植物和动物中已发现了大量不同miRNA， 植物中鉴定到的小RNA总量已非常大，且在水稻中迄今为止已鉴定到510个miRNA和1个tasiRNA家族。 水稻中miRNA的发生和作用模式与大部分植物一样，在植物中，大多数miRNA基因与基因间隔区，在细胞核内miRNA主要在RNA聚合酶Ⅱ(Pol-Ⅱ)的作用下转录为具有发夹结构的初级转录本(pri-miRNA)[6]；随后在双链RNA结合蛋白HYL1(hyponastic leaves1)[7]、锌指蛋白SE(Serrate)[8]、 G端结合蛋白TGH(touch)等蛋白的作用下， pri-miRNA被双链RNA专一性内切酶DCL切割生成茎环状前体pre-miRNA[9]；紧接着DCL在pre-miRNA的茎环处进行第二次切割，形成miRNA双链聚合体miRNA/miRNA*(miRNA*为反义链)[10]； 然后甲基转移酶HEN1(hua enhancer1)对miRNA/miRNA*进行甲基化修饰，防止其降解[11]；修饰后的miRNA/miRNA*在转运蛋白HST(hasty)的作用下从细胞核输出到细胞质中[12]。在细胞质中，miRNA双链聚合体解旋，反义链miRNA*被降解，成熟的单链miRNA结合到含有AGO(argonaute)蛋白和RNA解旋酶的RNA诱导沉默复合体(RISC)中，指导靶基因的表达[13-15]。 miRNA不仅在植物的生长发育中起着重要作用，它还是基因调控网络中的重要组成部分。在植物中，miRNA与靶基因mRNA的互补程度很高，匹配位点通常在开放阅读框中，导致mRNA与miRNA的匹配区中间位置特异性切割。目前已明确植物miRNA参与包括激素信号转导、细胞代谢、器官分化发育及育性转换等多个植物生长发育过程[16]。miRNA能响应生物及非生物胁迫，可以诱导产生phasiRNA(phased small interfering RNA)来参与到植物抗病的生理过程中[17]。 种子的灌浆、形态的发育直接影响着水稻的产量和质量。在水稻种子发育相关的调控网络中，miRNA通过控制营养物质的合成和运输发挥重要的作用[18]。miR397能够通过下调OsLAC基因的表达，促进油菜素内酯的信号转导，进而促进幼穗分支、增加种子尺寸，提高水稻产量[19]。在利用高通量测序技术和微阵列技术分析影响水稻种子发育过程中的小RNA时发现，miR159表达水平较高[20]。已有报道表明，miR159能够作用于调控糊粉细胞中α淀粉酶表达的赤霉素信号元件MYB，从而调节谷蛋白的表达，促进种子发育[21-22]。这与之前在拟南芥种子发育过程中发现的miR159的调控机制相似[23]。Wang等[24]的研究显示，水稻miR156能够作用于促进细胞分裂和灌浆的OsSPL16，在过表达OsSPL16的转基因水稻中，种子出现细长的表型，但是品质得到了提升且并提高了产量 [25]。糖类的合成和转化是水稻种子发育过程中的重要途径。尿苷二磷酸葡萄糖(uridinediphosphate glucose，UDPG)和果糖是淀粉合成的关键成分，而miR53能够调控Os02g58480基因影响蔗糖合酶( sucrose synthase，SuSy)的生成，促进蔗糖转化成 UDPG( uridine diphosphoglucose) 和果糖，进而影响淀粉的合成，提高籽粒中淀粉的含量[26-28]。水稻种子发育过程中还存在另一种糖类转化途径，miR1428e-3p通过调控Os08g37800基因编码合成蔗糖非酵解型蛋白激酶(sucrose non-fermenting 1-related protein kinase 1b，SNRK1b)，促进淀粉在胚乳和糊粉粒中的生成和积累，促进种子发育 [29]。可见，研究miRNA对种子发育的调控作用对提高水稻的产量和品质有重要意义。 水稻种子发育过程直接影响水稻产量和品质。虽然一些关于水稻种子性状的基因已经被鉴定和克隆，但是我们对种子发育形成的机制和调控网络了解还有限。本文通过鉴定水稻种子中的差异表达小RNA，并通过构建调控网络，深入了解miRNA及其靶基因对水稻生长发育的调控作用，对于进一步理解水稻种子发育的分子机制具有一定的价值。