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1 材料与方法
1．1 生理形态观察材料与方法
1．1．1 材料与试剂
1．1．1．1 植物材料
本实验以江苏省农博园葡萄基地多年生优质“白罗莎”葡萄（Rosario Bianco）为供试品种，在盛花期对花穗用50ppm的赤霉素（Gibberellin A3,以下简称GA）、50ppm的多效唑（Paclo-butrazol,PP333,以下简称PP）及清水对照处理，蘸取花穗30s，每组处理15个花穗，3次重复。在处理后初期每隔3-5天采样，果实发育期7-10天采样，液氮冻存。再形成幼果后将整果、果皮、果核区域、果肉分别冻样，储藏于－39℃冰箱中保存待用。本实验采样时间为2016年5月11日至2016年8月5日。
1．1．1．2 仪器
体式显微镜、直尺、电显式游标卡尺。
1．1．2 方法
1．1．2．1 形态观察
采样阶段实时拍照并使用直尺测量穗长、穗宽；采样后使用体式显微镜进行微观拍摄与比对，包括：子房或果实整体及纵横剖；电子天平称取不同时期各处理单果重量；电显式游标卡尺测量后期单果横纵径。
1．2 目的基因编码区克隆材料与方法
1．2．1 材料
1．2．1．1 植物材料
该部使用的植物材料与上一节相同。
1．2．1．2 试剂
液氮、无水乙醇、Tris、山梨酚、硼酸、PEG、CTAB、氯化钾、EDTA、醋酸钾、氯化锂、EB、巯基乙醇、氯仿、异丙醇、无菌水（2‰RNase水溶液）等。
反转录试剂盒、限制性内切酶、T4连接酶、T4buffer、rTaq酶、 dNTP、 DNA marker均购自Takara（塔克拉生物试剂有限公司）；凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自上海捷倍思基因技术有限公司；卡那霉素、氨苄青霉素、酵母提取物、琼脂、NaCl购自南京寿德有限公司。
pCAMBIA1302载体为实验室存样。
1．2．1．3 引物合成及序列测定
各个基因引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列测定由上海生工生物工程有限公司完成。
1．2．2 方法
DEPC水处理RNA提取所用的溶液和器皿工具，参照《分子克隆》有关RNA操作规范进行(Sambrook等,1989)。不同发育时期葡萄不同组织总RNA的提取参照CTAB方法（Wang.C ,2011）进行[16]。
1．2．2．1 RNA检测
（1）使用1%琼脂糖凝胶电泳检测提取总RNA。电泳图呈现28S、18S和5SrRNA三条条带。若条带较清晰明亮无明显拖带现象，且28S的亮度约为18S的两倍，OD值在1.9-2.1之间，则说明提取总RNA质量较好。
（2）用核酸蛋白分析仪，以溶解RNA的DEPC水为对照，测定260nm和280nm的光吸收值，如果OD260/OD280值介于1.9至2.1之间则符合要求。如果OD值过低或过高于此范围，说明有污染或降解。
1．2．2．2 cDNA的合成
（1）总RNA中DNA的消化
通过建立如下DNA消化体系(见表1)，将总RNA中的DNA进行消化。
表1 DNA的消化体系
Table 1 Digestive system of DNA
RNA
5xgDNA Eraser Buffer(2)
gDNA Eraser(1)
RNase Free H2O(6) ≤1ug
2uL
1uL
至10uL
Total Volume 10.0μL
在PCR仪内，42°C反应2min，4°C反应10s。
（2） cDNA第一链的合成
参照M-MLV反转录试剂盒（Takara生物试剂公司）合成cDNA第一链，以提取的总RNA为模板。具体操作方法如下：
①按照如下体系（表2）在DEPC水处理过的200μL PCR管中加入试剂。
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