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表2 cDNA的合成体系
Table 2 Synthesis system of cDNA
消化后的RNA
Primer Script RT Enzyme Mix I(3)
RT Primer Mix(5)
5x Primer Script Buffer2(4)
RNase Free H2O(6) 10.0μL
1.0uL
1.0uL
4.0uL
4.0uL
Total Volume 20.0μL
②在PCR仪中，37℃ 15min，85℃ 5s，4℃ 10s；
③反转后的cDNA用ddH2O进行稀释，分别稀释到 5倍，10倍；再分别用内参基因Actin标定不同样品的cDNA浓度。
④原液置于-40℃ 保存备用，稀释后的cDNA置于4℃ 短期保存。
1．2．2．3 引物设计
通过基因生物信息学分子中从NCBI下载的目标基因在葡萄中的基因序列，并分析获得其编码区，利用在线软件Primer3.0对编码区序列进行引物设计，并由上海生工生物工程有限公司合成。具体序列见表3。
表3 PCR引物序列
Table 3 PCR Sequence of primers
基因 引物名称 引物序列 退火温度
VvAGL15 VvAGL15-F1 ATGGGACGTGGTAAGATTGAGA 60.0
VvAGL15-R1 TTTAACTGCCAGAGTTGTTGG 59.7
VvAGL23 VvAGL23-F1 ATGCTTTGTGTAGTGAACATGGGGAG 63.4
VvAGL23-R1 TTACCCGAGATGGAGGACCTTCTTAT 62.6
VvLEC1 VvLEC1-F1 ATGGAGACTGGAGGCTTCCA 60.3
VvLEC1-R1 TCATTTGTACTGGGCATATGGTTC 59.1
1．2．2．4 PCR扩增反应
以上述提取的cDNA为模板，进行目的基因的PCR扩增，具体体系如下表4。
表4 PCR反应体系
Table 4 Reaction system of PCR
试剂 使用量
cDNA 2μl
PCR Forward Primer 1μl
PCR Reverse Primer 1μl
Buffer 2.5μl
dNTP 0.5μl
rRaq 0.2μl
ddH2O 17.8μl
Total 25μl反应程序：94℃， 5min； 94℃， 30S， 60℃， 30S， 72℃， 1min； 35 个循环后 72℃， 10 min；4℃保存。2%浓度琼脂糖凝胶电泳，检测目的条带。
1．2．2．5 PCR产物的回收
在切胶仪上切下 DNA 目的片段的凝胶块，使用上海捷倍思基因技术有限公司的试剂盒进行PCR产物回收，具体步骤详见产品使用说明。
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