1. 3 PCR扩增、测序
50μL的PCR反应体系,其中包括10μmol/L上下游引物各1ul、0.25μL Taq DNA聚合酶(Qiagen)、5μL 10xBuffer、1μL 10mmol/L dNTP、3.5μL Mgcl2以及100-200ng DNA模板,最后加入ddH2O补足50μL。反应条件为95℃预变性5min,35个循环反应:95℃变性30s,最佳退火温度(ITS 55℃、SSU 52℃、LSU 42℃、EF-1α 51℃)30s,72℃延伸(1000bp/min),最后72℃延伸10min。PCR产物用0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测,然后采用胶回收试剂盒(Qiagen)纯化产物,送于life technologies 测序公司ABI序列分析仪进行序列测定。为保证测序的准确性,采用双向测序,测序引物为 PCR 扩增引物。引物ITS-F的序列:5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3',引物ITS-R的序列:5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'。
1. 4序列差异分析
用SeqMan7.1.0软件进行正反向序列的拼接以及BioEdit 7.1.3软件校正序列。所有序列比对采用两种方法:MegAlign7.1.0软件中Cluster W全局比对和BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)局部比对;BLAST软件采用默认的DNA分值系统。所有生物信息数据用于评估各基因的碱基多样性和差异。
1. 5 ITS高通量数据库构建
将所有可检测的物种(序列差异度> 0.2%)的ITS测序结果按种名及所属的分类阶元归类,然后用Bowtie2以及BLAST软件分别构建高通量ITS核酸数据库,所有软件按默认参数建库。
2 结果与分析
2.1 ITS基因PCR及测序结果
ITS测序和PCR扩增情况统计见下表:红色:测序杂乱;蓝色:PCR条带较暗或无;绿色:测序无结果;橙色:测序无信号;白色:正常。
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