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致谢 7
参考文献 7
引言
随着科学技术的进步，人们生活质量逐渐提高，水产品的日需量呈上升趋势，使得我国的水产养殖业有很大的发展[1]。鱼塘养殖是我国饲养食用鱼的重要手段之一，在养殖过程中，鱼塘水体中的细菌对鱼类的生存带来了很大的影响。在整个生态系统中，细菌占据重要地位，对鱼塘环境中的物质循环有很大影响，它不仅作为分解者，也是鱼类重要的生存指标[2]，且细菌在促进水体中有机物分解、营养盐释放和保持良好的水质方面也发挥了极大的作用[3]。
近年来，很多国内外科学家对鱼塘中的细菌做出分析与研究，包括细菌的多样性、群落结构、对鱼类生存的影响、特殊菌株细胞生活机制等。如Ahmed H. Al-Harbi和M. Naim Uddin研究沙特阿拉伯某鱼塘水体底泥中细菌群落随季节变化的特点，发现不同季节鱼塘水体底泥中的细菌数量各不相同，其中夏季鱼塘水体底泥中细菌的数量达到了高峰[4-5]；程莹寅、吴山功对养殖草鱼鱼塘水体中细菌的多样性特征进行了研究，表明鱼塘水体底泥中细菌含量十分丰富且存在致病菌种，给鱼塘中草鱼的生存带来威胁[6]；邵桂元、沈启华对影响鱼类健康的细菌进行了研究，发现蛭弧菌可减少鱼塘中鱼类疾病的发生，降低鱼类死亡率[7]；杨艳、刘萍等人研究了芽胞杆菌属对养殖鱼塘水质的影响，其中巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）对鱼塘水质净化具有明显作用[8]。充分研究徐州北郊鱼塘水体中细菌的数量变化及致病菌对鱼类生存的影响将有助于我们了解鱼塘生态系统中的这一重要资源，给鱼类养殖模式的优化及有效控制病害发展带来重大的意义[9]。
16S rRNA基因序列检测技术近年来应用广泛，如曹波、杨红等人曾利用16S rRNA基因测序技术检测长江口细菌得到细菌群落组成[10]；朱诗应、戚中田的研究表明16S rDNA测序技术能够区分细菌并将其鉴定到具体种水平[11]。16S rRNA基因是核糖体RNA的一个小亚基，由16S rDNA编码而来[12]。本研究通过提取徐州北郊鱼塘水体中的菌种并抽提其总DNA组进行电泳分析，PCR扩增16S rRNA并测序，构建系统发育树进行分子发育学分析的方法检测出水体中9种不同的细菌，分析该鱼塘中细菌的多样性及致病菌的功能作用，为鱼塘健康养殖提供理论依据，进一步实现鱼塘的合理放养以及科学管理。
1材料与方法
1.1 材料
1.1.1 水样采集
本试验所选用的水体样品于2014年12月采集于徐州北郊鲫鱼养殖鱼塘。用采水器采样，4℃保存。
1.1.2 配制培养基
试验前配制好培养基，放置在高压蒸汽灭菌锅中灭菌备用，温度设置为121℃，时间为25 min。
1.1.3 试验仪器
移液枪、电泳仪、PCR扩增仪、恒温培养箱、离心机、灭菌锅、DNA回收试剂盒、BIO-RAD凝胶成像系统。
1.2方法
1.2.1 对菌种进行划线分离与纯化并斜面保存
采取水样后，4℃保存。试验前取1mL水样接种到灭菌后的固体培养基上，放置在37℃环境下培养3d。对平板上的单一菌落反复划线以达到分离目的，最终得到纯菌株，接种至斜面并保存。
1.2.2 Gram stain染色
若在显微镜下观察到的染色结果为紫色，则可以判断为革兰氏阳性菌；若在显微镜下观察到的染色结果为红色，则可以判断为革兰氏阴性菌。
1.2.3 细菌总DNA抽提及电泳分析
抽提细菌总DNA基因组放置在-20℃条件下保存，对其进行电泳，ddH2O漂洗，溴化乙啶染色，最后采用BIO-RAD系统拍照。