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摘要：芽孢杆菌D1菌株是从堆肥中分离出来的一种以香草酸为唯一碳源和氮源生长的嗜热芽孢杆菌。它的生长的温度范围在50−70 ºC，最适生长温度为55ºC。D1菌株是一个优秀的环境污染物降解菌株。D1菌株利用一个叫做NIH shift的反应降解对羟基苯甲酸，该反应机制尚不明了。本论文为了阐明NIH shift的全貌，首先对D1菌株的基因组进行测序，探索NIH shift相关基因。为了从基因水平，代谢水平上阐明降解机理，摸索了利用紫外线照射法构建突变株基因文库的方法。通过控制UV照射时间，使存活率控制在20%~30%之间最终成功得到了D1菌株的突变株基因文库，并进行冷藏保存。35827
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毕业论文关键词：芽孢杆菌，基因文库，紫外照射，突变株
Bacillus strains D1 genome sequencing and mutant gene library building
Abstract: Bacillus strains isolated from compost D1 a vanillic acid as sole carbon source and nitrogen source of thermophilic bacillus. The growth of its temperature ranges from 50-70 DHS C, the optimum growth temperature is 55 DHS C .D1 strains is an excellent environmental pollutants degradation strains.D1 strains using a process called NIH shift the reaction of the degradation of p-hydroxy benzoic acid, the reaction mechanism is still unknown.This paper in order to clarify the outline of the NIH shift, the genome sequencing of D1 strains, explore the NIH shift related genes.For from the level of genes, metabolism to clarify the degradation mechanism, grope for the use of ultraviolet radiation method build mutant gene library method. By controlling the UV irradiation time, makes the control of survival rate between 20% ~ 30% final success in getting D1 strain of the mutant gene library, and cold storage.
Key words：Bacillus，Gene library，Ultraviolet irradiation，Mutant strains
目录
引言 1
1 材料与方法 2
1.1菌株材料 2
1.2主要试剂 2
1.2.1生化试剂与分子生物学试剂 2
1.3 方法 2
1.3.1 DNA提取 2
1.3.2 PCR扩增16S rDNA 4
1.3.3提取质粒 5
1.3.4 16s RNA测序 5
1.3.5 全基因组测序、合同签订 5
1.3.6最适照射时间 5
2 结果与分析 6
2.1 总DNA提取 6
2.2 PCR扩增16S rDNA 6
2.3 PCR反应产物检测及纯化 7
2.4 验证D1菌株中有无质粒 8
2.5 16S rDNA测序 9
2.6 检索并绘制系统发育树 10
2.7 全基因组测序 10
2.8 最适照射时间 12
3 讨论 14
致谢 14
参考文献 14
引言
芽孢杆菌D1菌株是从堆肥中分离出来的一种以香草酸为唯一碳源和氮源的嗜热芽孢杆菌。它的生长的温度范围在50−70 ºC，最适生长温度为55ºC。D1菌株是一个优秀的环境污染物降解菌株。D1菌株利用一个叫做NIH shift的反应降解对羟基苯甲酸，该反应机制尚不明了。关于对羟基苯甲酸（4 - hydroxy benzoic acid，4HBA）的微生物降解研究从上世纪五十年代开始到现在已经开展了许多研究工作。在一部分好氧微生物中，4HBA的降解首先由单加氧酶（monooxygenase）或水解酶（hydroxylase）把4HBA转化成原儿茶酸（protocatechuic acid, PCA）[7][15]。原儿茶酸是一个可以被双加氧酶开环的化合物。最终代谢产物进入三羧酸循环。
有些菌株对4HBA的降解是通过邻苯二酚（catechol）开环途径。这个途径的关键酶是4-羟基苯甲酸脱碳酸酶（4-hydroxybenzaote decarboxylase），催化4HBA的脱碳酸反应生成苯酚[13][15]。而后在单加氧酶的催化下转化成邻苯二酚，然后双加氧酶在1,2位或2,3位间将其开环，进入三羧酸循环[1]。