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    天冬氨酸转氨酶是转氨反应的高效催化剂,并且对细胞中氮和碳的代谢起到非常重要的作用。在模式真菌酿酒酵母中,天冬氨酸转氨酶仅由一个基因AAT2编码,在S288C菌株背景中AAT2缺失不致死,但在Sigma1278b菌株背景中AAT2是必需基因,缺失致死。S288C中AAT2基因缺失引起一系列表型缺陷[5,6],包括生长速率下降,在富营养培养基上适合度下降,对温度敏感,且表现出对多种DNA合成抑制剂和高渗透胁迫更加敏感,表明在酿酒酵母中AAT2基因在菌体生长发育和适应外源环境过程中具有重要作用。
    本论文在引起麦类赤霉病的禾谷镰孢菌基因组中通过比对鉴定到6个编码天冬氨酸氨基转移酶的同源基因,拟通过基因敲除技术研究这6个AAT2基因的生物学功能。本论文的主要内容包括6个AAT2基因敲除载体的构建,通过PEG介导的原生质体转化获得相应基因的转化子,再对转化子进行验证,获得原位插入的敲除突变体,为下一步生物学功能的分析提供材料。

    1  材料与方法
    1.1  材料
    1.1.1  实验菌株与质粒
    ①禾谷镰刀菌野生型菌株PH-1和GZ3639,菌株放于25℃培养箱培养。
    ②质粒pBlueScript-HPH

    1.1.2  常用培养基
    ①PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)培养基:
    土豆    200g
    葡萄糖    20g
    琼脂条    20g
    加dd H2O定容至1000ml,于121℃高压灭菌20分钟。

    ②YEPD(酵母粉蛋白胨葡萄糖琼脂)培养基:
    蛋白胨    10 g
    酵母粉    3 g
    葡萄糖    20 g
    用1 mol/L NaOH溶液 将pH值调至7.5,加dd H2O定容至1000ml,121℃高压灭菌20 分钟。

    ③绿豆汤产孢培养基:
    绿豆    15 g
    水煮40分钟后用三层纱布过滤,加dd H2O定容至1000 ml,于121℃灭菌20分钟。
    ④LB 培养基:
    胰蛋白胨    10g
    酵母粉    5 g
    NaCl    10 g
    用1 mol/L NaOH溶液将pH值调至7.5,加dd H2O 定容至1000 ml,于121℃高压灭菌20 分钟。

    ⑤RM培养基:
    水解溶蛋白(Casein hydrolysate)    1 g
    酵母粉    1 g
    蔗糖    274 g
    用1 mol/LNaOH 溶液将pH值调至7.5,加dd H2O定容至1000 ml,121℃高压灭菌20 分钟。
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