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摘 要：多菌灵在现代农业生产中被广泛应用，造成了严重的环境污染。微生物降解环境污染物是目前研究的热点。本文以多菌灵高效降解菌djl-10为材料，通过生物信息学分析和PCR扩增，获得了该菌株负责多菌灵降解第一步反应的关键酶基因，命名为mheII。通过载体构建方式成功地构建了该基因的重组表达载体pET29a-mheII，并在大肠杆菌BL21菌株中实现了功能表达。采用Ni-IDA亲和层析方法从重组表达菌株中纯化了多菌灵水解酶，并初步研究了该酶的催化活性。本论文从基因和酶的水平上初步阐明了菌株djl-10降解多菌灵第一步水解反应的机理。58460
毕业论文关键词：基因mheII，多菌灵水解酶，异源表达，农药降解
Abstract: Carbendazim was widely used in modern agricultural production and caused severe environmental pollution. Microbial degradation of environmental pollutants is a hotspot of the current research. In this work, a carbendazim degrading strain djl-10 was used as the research material. The key enzyme encoding gene named mheII that is responsible for the first step in carbendazim degradation reaction was cloned from strain djl-10. The gene recombinant expression vector pET29a-mheII has been constructed successfully. The function expression of the enzyme MheII was realized in E. coli BL21 strain. The carbendazim hydrolase was purified from recombinant expression strains by the method of Ni-IDA affinity chromatography and the catalytic activity of the enzyme was also studied preliminarily. This work clarified the first step hydrolysis reaction mechanism of carbendazim degrading by strain djl-10 on the gene and enzyme level.
Keywords: gene mheII; carbendazim hydrolase; heterologous expression; pesticide degradation
1 前言 4
2 材料与方法 4
2.1供试菌和试剂 4
2.2 培养基 5
2.3 实验方法 5
2.3.1 多菌灵水解酶基因的克隆 5
2.3.2 PCR产物TA克隆验证 6
2.3.3 多菌灵水解酶基因序列分析 6
2.3.4 多菌灵水解酶基因重组表达载体pET29a-mheII构建 7
2.3.5 表达载体pET29a-mheII转化到感受态E.coli BL21细胞 7
2.3.6 重组表达载体pET29a-mheII的诱导表达 7
2.3.7 SDS聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳分析 8
2.3.8 MheII纯化 8
3 结果与分析 9
3.1 多菌灵降解菌株总DNA的制备 9
3.2 疑似基因的PCR扩增 9
3.3 PCR产物TA克隆验证 10
3.4 多菌灵水解酶基因序列分析 10
3.5 基因片段及表达载体片段的酶切回收 10
3.6 表达载体pET29a-mheII构建 11
3.7 重组基因pET29a-mheII的诱导表达及SDS-PAGE分析 12
3.8 MheII纯化 13
结论 14
附录1 15
附录2 16
参考文献 17
致谢 19
1 前言
多菌灵，化学名称N-（2-苯并咪唑基）氨基甲酸甲酯，是一种应用广泛的高效广谱的内吸性杀菌剂，对果树、蔬菜等多种农作物具有较好的病害防治作用[1-2]。但是，多菌灵的化学性质稳定，在土壤中降解半衰期较长（3~6个月），能持久地残留在使用部位，在蔬菜和土壤中残留积累，最终会通过食物链威胁人类的健康。据研究，多菌灵存在潜在的致癌、致畸、致突变的三致作用，对哺乳动物有一定的毒害作用,能引起哺乳动物肝病、导致染色体畸变而影响后代繁衍等[3-5]。2002年被我国列为环境激素类化学农药[6]。