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摘要：多菌灵在现代农业生产中被广泛使用，造成了严重的环境污染。目前，对多菌灵微生物降解研究报道较少，微生物降解多菌灵的分子机理尚不清楚。鸟枪法是一种克隆功能基因的成熟且常用的方法，本文以多菌灵高效降解菌株djl-10为研究材料，成功构建了该菌株基因组文库，共得到2016克隆子，为进一步深入研究该菌株降解多菌灵在基因水平上的机理奠定了基础。59754
毕业论文关键词：多菌灵，djl-10，降解基因，基因文库
Abstract: MBC is widely used in modern agricultural production and has caused severe environmental pollution. At present, few research on the MBC microbial degradation were reported, and the molecular mechanism is not yet clear. Shotgun technique is a mature and common method for functional genes cloning. In this work, a bacterium strain djl-10 with high efficiency degradation of MBC was used as research material for the genomic library construction. 2016 clones were screened out. The result laid the foundation for further study of the MBC degradation mechanism at the gene level of this strain.
Keywords: MBC, strain djl-10, degrading gene, genomic library
1前言 4
2 材料与方法 5
2.1培养基和试剂 5
2.2 供试菌株 5
2.3 主要仪器 5
2.4 菌株基因组文库的构建 5
2.4.1 菌株基因组DNA的提取 5
2.4.2 DNA随机酶切条件的摸索 5
2.4.3 DNA随机酶切及目的片段的回收 6
2.4.4 DNA回收片段与载体酶连 6
2.4.5酶连产物转化E.coli DH5ɑ菌株感受态细胞 7
2.4.6文库构件质量考察 7
3 结果与分析 7
3.1 菌株基因组DNA的提取 7
3.2 DNA随机酶切条件的摸索 8
3.3 DNA随机酶切及目的片段的回收 9
3.4 酶连产物转化E.coli DH5ɑ菌株感受态细胞 10
3.5文库构建质量考察 10
结论 12
参考文献 13
致谢 14
1 前言
多菌灵( carbendazim，MBC)，化学名称为苯并咪唑-2-氨基甲酸甲酯，是一种高效低毒的广谱内吸性杀菌剂。自20世纪70年代中期，其迅速代替有机汞、有机硫杀菌剂，被广泛应用于水稻、棉花、蔬菜、果树和药材等由半知菌和多子囊菌等真菌引起的病害防治[1]。同时，多菌灵还是许多苯并咪唑类杀菌剂的主要水解产物和有效成分[2]。
据统计，我国2006年农药需求总量(有效含量)为29.96万t，其中多菌灵的需求量在0.8～1.0万t[3]。农业生产中，多菌灵通常是重复多次使用，特别是在设施蔬菜生产过程中，由于病害多发、高发，多菌灵使用量大且施用频率高[4]。多菌灵的化学性质稳定，在环境中的降解半衰期较长，在蔬菜、果品和土壤中残留与累积，可通过食物链影响人体健康[5]。已有研究表明，多菌灵能够干扰哺乳动物的内分泌，并对精母细胞的减数分裂产生影响[6, 7]。此外多菌灵能引起肝病[8]，还能导致染色体畸变[9, 10]等病症。
多菌灵很难被水解，热解和光解等物理方法分解，在生态系统中，微生物对农药的分解起着重要作用。为研究农药降解菌基因组结构功能及细菌降解的基因，最普遍的方法是先建立该菌株的基因组文库[11]。基因组文库的构建是应用限制性内切酶酶切细胞基因组DNA，得到大量随机切开的基因组DNA片段，然后将这些带有基因的DNA片段与载体连接，克隆到宿主细胞中，通过一系列方法筛选出阳性转化子，并测序获得目标基因序列，这样的克隆方法常被称为鸟枪法[12]。