1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 植物材料
水稻日本晴野生型(Oryza sativa cv.Nipponbare L.),突变体材料,烟草(N.benthamiana)
1.1.2 菌株、载体
菌株:农杆菌EHA105;大肠杆菌DH5α、BL21均为本实验室保存菌株
载体:Venus,pGEX-4T和pET-28a
1.1.3 主要试剂、试剂盒
主要试剂、试剂盒:限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、DNA Ligase/KOD/DNA marker、质粒提取/PCR产物/琼脂胶回收试剂盒;烟草叶片侵染液MES、烟草叶片侵染液乙酰丁香酮、X-Gluc底物、PBS Buffer、还原型谷胱甘肽GSH、IPTG、SDS、PBST、Mutazyme、谷胱甘肽巯基转移酶(GST);小麦(Triticum aestivum) E1(GI: 136632)、E2(AtUBC8)、AtUBQ14(At4g02890)、OsMYBc、OsMSRFP
1.2 研究方法
1.2.1 烟草瞬时表达方法
取光照/黑暗16/8小时,23-24℃培养4周左右的烟草,用1 ml一次性注射器吸取侵染液重悬的转有表达质粒的农杆菌液,从烟草叶片的背面注入到叶片中,适宜培养条件下表达48-60小时。
1.2.2 GUS活性测定
将植物组织加液氮研磨成粉末,加入GUS蛋白提取液后离心,收集上清冰上保存。之后取少量样品蛋白提取液,加入到反应液中,在反应进行中的第20 min和第40 min各取20 µl反应混合液加入到180µl Na2CO3溶液中停止反应;分别在激发波长365 nm,发射波长455 nm下测定荧光值。
1.2.3 质粒提取方法
将转有待提质粒的大肠杆菌单菌落接种于10 ml 含合适抗生素的LB液体培养基中,37℃,200转/分钟,摇菌14-16小时;之后将上述菌液转接到1L新鲜含合适抗生素的LB液体培养基中,37℃,200转/分钟,摇菌过夜;收集菌体后按照质粒提取试剂盒提取质粒。
1.2.4 GST标签蛋白原核表达及纯化
表达蛋白载体转入大肠杆菌BL21菌株中,阳性菌落转接至10 ml含Amp的LB液体培养基中,小摇过夜;之后以1:50的比例转接到200 ml含Amp的新鲜的LB液体培养基中,大摇。摇菌至OD600在0.8-1.0之间时,加入IPTG诱导表达。收集菌体后加入预冷PBS悬浮菌体,添加PMSF,超声破碎仪破碎细菌细胞以释放蛋白。将上清注入装载有1 ml glutathione-SepHarose 4B琼脂糖吸附柱中,4℃结合1小时。用预冷8倍体积的PBS冲洗吸附柱,收集洗脱成分,测蛋白浓度,做免疫印迹检验。
1.2.5 免疫印迹(Western Blot)检测
蛋白样品加SDS上样缓冲液,沸水中变性5-10 min后上样跑SDS-PAGE,活化PVDF膜以备转膜。转膜结束后,将PVDF膜浸泡在装有封闭液的培养皿中封闭30 min,期间放在脱色摇床上轻摆震荡。倒掉封闭液,加入GST一抗反应液,置于摇床上,反应3小时。回收一抗反应液,用PBST洗PVDF膜,3次×15min,再加入二抗反应液,置于摇床上,反应1.5小时。将PVDF膜浸入碱性磷酸酶底物显色液中显色,直至出现反应条带,用PBST洗掉显色液,膜晾干保存。
1.2.6 点突变实验
设计引物,进行PCR扩增。PCR产物体系中加入1 µl MutazymeTM37℃反应1小时消化甲基,之后转化PCR产物,做菌落PCR验证,测序确定正确质粒。
1.2.7 双分子荧光互补BiFC
将MYBc和MSRFP的CDS序列分别克隆入Venus的N端和C端,构建VN(R)-MYBc和MSRFP-VC。用VC和VN(R)做阴性对照。利用农杆菌侵染烟草进行体内瞬时表达,处理3天后收集烟草叶,使用Leica TCS SP5共聚焦激光扫描显微镜检测荧光。