国内外LPPs的研究主要集中在动物中,且相对成熟[6],而在高等植物的拟南芥中只有相对较少的研究。拟南芥有4个LPPs基因,它们在拟南芥中的定位号分别为AtLPP1(At2g01180),AtLPP2(At1g15080),AtLPP3(At3g02600),AtLPP4(At3g18220)[1]。它们在拟南芥中的作用是催化水解焦磷酸甘油二脂 (DGPP)去磷酸化生成磷脂酸(PA),并进一步催化磷脂酸(PA)去磷酸化生成二酰基甘油 (DAG)[3], 它们在细胞膜上的作用主要用于维持焦磷酸甘油二脂(DGPP) 、磷脂酸(PA)、二酰基甘油(DAG)三种物质的平衡[2]。目前关于植物中LPPs的研究还比较少,LPPs很多的性质还不清楚,特别是蛋白水平上的研究,关于这个酶的具体功能、活性等有待进一步的研究。
盐胁迫下,拟南芥细胞中的焦磷酸甘油二脂 (DGPP)和磷脂酰基醇-4,5-二磷酸含量会明显上升[7]。这说明盐胁迫下,脂物质参与了细胞内的盐信号途径。前期研究表明,AtLPP2作为管家基因在各种胁迫下含量基本保持不变,LPP2主要在拟南芥的萌发过程中通过磷脂酸(PA)信号途径起作用,它对种子的萌发起到抑制作用[2],而AtLPP1则不同,它广泛响应各种生物和非生物逆境[4](图1-A)。
拟南芥中LPP1参与盐胁迫信号途径,研究表明lpp1纯合突变体对盐胁迫敏感,与野生型相比,植物体内有更多的钠离子积累,同时更多的钾离子流失[8],引起植株严重失水,而且植株体内的脯氨酸含量显著上升,最后导致膜电解质渗漏率上升,膜破裂,植株死亡。探其原因在于,AtLPP1的缺失直接导致其下游产物即细胞膜上的磷脂酸(PA)减少,从而降低了植物的耐盐性[4]。而在现在的研究中,该基因应答信号的分子机制与LPP1蛋白的定位还不是很清楚,一些重要的分子机制尚不明确,LPP1是如何作用的机理还不太清晰。我们研究LPP1基因旨在揭示其抗盐的分子机理,为遗传育种提供一条新的重要道路。
图1:盐胁迫下,四种LPPs在不同时间段相关表达量的变化
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 拟南芥遗传材料
拟南芥lpp1突变体株系:SALK-129705、CS876901、CS875534、CS872267购于Arabidopsis Biological Resource Center。野生型(Col-0)拟南芥植株由章文华教授实验室提供。
1.1.2 实验载体及菌株
表1.实验载体及相关菌株
载体(菌株)名称: 抗性: 来源:
pGEM-T vector Ampicillin TakaRa公司
PBI101 Kanamycin 章文华教授实验室
GFP-1300 Kanamycin 章文华教授实验室
AtU6 Kanamycin 鲍依群教授实验室
Cas9 Spectinomycin 鲍依群教授实验室
DH5α ---- TakaRa公司
GV3101 利福平+ 章文华教授实验室
1.1.3 实验试剂
表2.实验试剂
实验试剂: 来源:
限制性内切酶 Thermo
Taq DNA聚合酶 上海翔圣生物公司
DNA Ligase/KOD/DNA marker TakaRa/Thermo/NEB
质粒提取/PCR产物/琼脂胶回收试剂盒