隆番茄前体和成熟SlmiR156基因全长;
2)构建PVX病毒介导的SlmiR156超表达载体:利用PVX载体上特异性酶切位点`751~文[论]文'网www.751com.cn,将上述克隆得到的SlmiR156前体和成熟体序列插入PVX载体,得到PVX介导的超表达载体;
3)烟草转化试验:将上述超表达载体经SpeI酶切后进行体外转录得到相应的mRNA,转化烟草并收集烟草发病叶片,冷冻干燥后于-80℃保存;
4)SlmiR156对番茄果实成熟的影响:将含有PVX病毒介导超表达的SlmiR156前体和成熟体的烟草病汁液通过果柄注射入番茄果实,以注射含PVX空载体的烟草病汁液和Elution Buffer为对照,比较观察实验组和对照组中番茄果实成熟后的表观形态的影响,初步得到SlmiR156在番茄果实后熟中的作用。
2 实验内容
2.1 实验材料与设备
2.1.1 实验材料与试剂
植物材料本氏烟(Nicotiana benthamiana, Nb)和番茄野生型(Ailsa Craig,AC)均为大学生命与环境科学学院植物RNA信号转导中心所有。本氏烟Nb和番茄野生型AC均种植在常年不间断运行的温室中,培养条件为16h光照/8h黑暗,温度25℃。
病毒载体PVX/HisG-MF1为杭州师范大学生命与环境科学学院植物RNA信号转导中心所有论文网,储存于DH5α中,-80℃保存;pEASY-Blunt simple T vector和大肠杆菌感受态DH5α购买于北京全式金生物有限公司;限制性内切酶ClaI和EagI购买于New England Biolabs(NEB)公司;DNA Marker(DL500、DL1000、DL2000、DL15000)和DNA聚合酶primerSTAR购买于TAKARA公司;植物RNA抽提试剂盒、PCR产物回收试剂盒、PCR产物割胶回收试剂盒和质粒抽提试剂盒等购买于QIAGEN公司;引物合成和测序由上海invitrogen公司提供;其他常规生化试剂,包括抗生素氨苄青霉素(Amp+)和LB培养基等均购买于上海生工生物有限公司。