转cyp2e1基因水蕹菜及其清除水体有机污染物的分析(2)

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发根农杆菌属于根瘤菌科，为革兰氏阴性细菌。发根农杆菌可以通过侵染植物细胞来生成许多不定根，而由于这些不定根成毛状、散发状态，而且生长迅速，故称其为毛状根。导致毛状根产生的原理是当农杆菌侵染植物后，农杆菌中的T-DNA插入、整合到宿主植物基因中，并能够进行正常的表达和遗传作用。本研究所采用的发根农杆菌K599其野生型是由澳大利亚学者Allen Kerr从土壤中分离而得[5]。目前利用发根农杆菌介导实现水蕹菜遗传转化的实例在国内外未见报道。

本研究利用农杆菌转基因技术将cyp2e1基因转入水蕹菜中，以达到有效提高水蕹菜对有机污染的修复能力的目的，进一步提高水蕹菜对水体复合污染的综合修复能力。

2. 材料与方法

2.1 实验材料

柳叶水蕹菜种子购置于浙江省农科院种子公司。cyp2e1基因从兔肝细胞中通过RT-PCR克隆获得，含有cyp2e1基因的植物转基因表达载体pSLD50-6由美国华盛顿大学Doty教授提供。利用冻融法将pSLD50-6导入感受态发根农杆菌K599细胞中，构建重组型发根农杆菌K599。重组型发根农杆菌K599（带内源质粒pRi2659和外源质粒pSLD50-6）由本实验室前期转化和保存。

2.2 实验方法

2.2.1 水蕹菜无菌苗的获得

使用0.1%升汞对种子进行消毒7.5 min，然后接种在1/2MS(0)培养基上，22±2℃,进行光照培养。培养7天萌发出的小苗，剪取靠顶端的带叶茎段作为外植体，转入MS +0.5 mg/L 6-BA + 0.25 mg/L IAA培养基上培养，22±2℃,光照培养，获得再生的无菌苗。

2.2.2 含cyp2e1基因发根农杆菌侵染菌液的准备

cyp2e1基因从兔肝细胞中通过RT-PCR克隆获得，含有cyp2e1基因的植物转基因表达载体pSLD50-6由美国华盛顿大学Doty教授提供。利用冻融法将pSLD50-6导入感受态发根农杆菌K599细胞中，构建重组型发根农杆菌K599。发根农杆菌K599/ pSLD50-6或pKH200于LB+Km 50 mg/L+Str 50 mg/L液体培养基28℃，200 r/min培养至OD600为0.5左右，离心管收集菌液并用MS液体培养基悬浮清洗3次，作为侵染的菌液。

2.2.3 毛状根的诱导

将在MS +0.5 mg/L 6-BA + 0.25 mg/L IAA培养基上再生的组培苗完整植株，切割分株后，转入1/2MS(0)培养基上，当转移10-15天后，株高在5.5-6 cm时将解剖针在酒精灯上灼烧灭菌、冷却后，在植株不同部位用针尖分别刺入，形成创伤。然后使用用微量加样器吸取1滴(10 L左右)含有重组型发根农杆菌K599（含cyp2e1基因）的菌液滴加在伤口处。观察获得毛状根的情况