基于环化剪接的植物基因簇克隆与重构(2)

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1引言.1

1.1植物次生代谢产物.1

1.2生物合成..2

1.3基因簇克隆方法..2

1.4CRISPR/Cas9染色体编辑技术..3

1.5FLP/FRT重组系统4

1.6工作目的和意义..4

2EXCY系统的构建.5

2.1材料与方法.5

2.2结果..12

2.3讨论与分析..12

3EXCY模块的整合..14

3.1材料与方法..14

3.2结果..15

3.3讨论与分析..16

4Noscapine基因簇的环化.17

4.1材料与方法..17

4.2结果..18

4.3讨论与分析..18

5酵母受体细胞的构建.19

5.1材料与方法..19

5.2结果..22

5.3讨论与分析..22

6环状Noscapine基因簇的整合.24

6.1材料与方法..24

6.2结果..25

6.3讨论与分析..25

7Noscapine基因簇的表达.26

7.1材料与方法..26

7.2结果..27

7.3讨论与分析..27

结论28

致谢30

参考文献..31

附录A实验中主要仪器设备..34

附录BEXCY系统构建中所用引物序列35
1 引言 1.1 植物次生代谢产物植物次生代谢产物是植物在初生代谢基础之上产生的一类非自身生长发育正常进行所必需的结构复杂的小分子有机化合物，一般由糖类、蛋白质、脂类和核酸等初级代谢产物经一系列复杂的酶促反应转化而成[1]。植物次生代谢产物是一类具有重要研究价值的植物天然产物，根据其化学结构的不同可分为萜类、酚类和含氮化合物三大类[2]，它们不仅在植物生命活动过程中发挥着重要作用，并具有丰富多样的生物活性，例如一些植物能分泌苯并噁唑嗪酮类毒素进行自我防御[3]，萜类化合物中二萜类紫杉醇具有显著的抗癌活性[4]、环氧化的倍半萜内酯青蒿素是目前最有效的抗疟疾药物[5]，甾类生物碱中贝母碱具有抗菌活性、降血压作用[6]，异喹啉类生物碱中诺斯卡品具有镇咳、抗肿瘤活性[7]，血根碱具有抗癌活性[8]以及氰苷类化合物苦杏仁苷是治疗癌症的辅助药物[9]，这些天然化合物物广泛应用于药物、杀虫剂或除草剂等。苯基异喹啉类生物碱Noscapine是来源于Papaver somniferum 的次生代谢产物，作为新型抗癌药物，具有抗肿瘤活性高、毒副作用小，作用机制独特等特点，它可在人类细胞中结合微管蛋白，将细胞周期阻断在有丝分裂中期。生物信息学分析显示，Noscapine 是由 10 个基因编码 5 种独特的酶而合成的，这 10 个基因作为一个复合基因簇而存在。据此，Thilo Winzer等人[10]ᨀ出了Noscapine生物合成途径的新理论，合成途径如图 1.1 所示，这为在异源宿主中完整合成该物质奠定了基础。科学研究及临床试验表明，目前制药工业的主要来源仍以植物天然产物为主[11]，但这些化合物一方面由于结构复杂而难以进行化学合成[12]，另一方面由于天然产量较低，直接从植物中ᨀ取、分离困难，因而限制了其大规模生产[13]。
1.2 生物合成针对复杂天然产物含量稀少，化学合成困难的问题，合成生物学为该类化合物的合成开辟了新的道路。随着基因组学与生物信息学的迅速发展，新一代DNA测序技术能快速获得物种的遗传多样性，植物次生代谢产物复杂的合成路径逐渐被阐明，植物和微生物强大的生物合成能力进一步被挖掘，这些成果为异源宿表达植物次生代谢产物奠定了基础。大肠杆菌和酵母因其具有优良的生长性能和完善的基因操作工具而常作为异源表达宿主[14]。自Pfeifer 等人2001年利用大肠杆菌异源合成出复杂聚酮类抗生素以来[15]，微生物异源合成次生代谢产物的研究发展十分迅速。近来的研究中已经在微生物宿主中成功合成了萜类、黄酮类、苯基异喹啉类生物碱等复杂植物天然产物，例如2012年，Nakagawa等利用大肠杆菌合成苄基异喹啉类生物碱的前体分子(S)-牛心果碱的研究已取得成功[16,17]；2013年，Keasling等在酵母中高效合成了青蒿素抗疟药前体青蒿酸[18]；2014年，Fossati等在酿酒酵母中成功重建了二氢血根碱合成路径[19]。这些例子表明在微生物宿主中重构植物天然产物的合成途径，通过优化复杂的代谢途径，实现复杂化合物的异源表达，不但为解决植物天然产物来源不足ᨀ供了便捷，而且天然产物的生物活性得以优化[20]。因此，利用合成生物学策略进行植物次生代谢产物的生产有望为制药工业ᨀ供稳定的药物来源，是一项极具潜力的技术[21,22]。