菜单
  

    ABA-胁迫-成熟诱导(ASR)蛋白是一类渗透调节蛋白家族,在逆境胁迫下,其在水稻细胞内的含量会增加,形成单体或二聚体以保护细胞膜结构,参与逆境响应。而ATP合酶广泛分布于线粒体、叶绿体的膜结构上,参与光系统的氧化磷酸化和光合磷酸化,合成ATP为生命活动提供能量。有研究表明,当水稻植株遭遇逆境时,抗逆性强的品种其光合作用仍保持较高水平,ATP合酶表达量在一段时间内降低幅度小[4]。这三个蛋白家族都与水稻耐镉有关系,故将其作为研究对象。
    现在各种生化和分子的研究方法发展趋近成熟,如聚合酶链式反应技术(PCR)、琼脂糖凝胶电泳技术、大肠杆菌和酿酒酵母的转化和培养等。大肠杆菌和酵母作为常用的模式生物,是很好的外源基因表达系统,不仅繁殖迅速,易于获得和培养,操作简单,而且可以稳定地复制表达[5],非常适合作为目的基因的扩增和验证工具。本研究以水稻中与耐镉机制相关的基因为研究对象,通过PCR技术扩增得到大量相同片段,连接上pMD19-T载体以后利用大肠杆菌感受态细胞转化得到质粒,经酶切验证后连接到目的载体pYES2上,再利用大肠杆菌,转化得到质粒,转入酿酒酵母中,挑取单菌落培养,得到菌液后配成浓度梯度溶液,在含镉培养基上培养,观察转化子的耐镉情况。
    1  材料与方法
    1.1 实验材料
    基因材料:水稻植株的DNA
    感受态细胞及菌株:大肠杆菌E.coli DH5α pMD19-T Vector购自康为世纪生物科技有限公司;酵母菌株Δycf1、yod。
    其他试剂:琼脂糖凝胶回收纯化试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司,测序工作交由南京思普金生物科技有限公司,其余试剂和材料均购自国产或进口公司。
    主要仪器和设备:PCR仪,离心机,电泳仪,水浴锅,超净工作台,灭菌锅,恒温震荡培养箱。
    1.2  实验方法
    1.2.1 目的基因的扩增与回收
    PCR扩增出目的基因,反应体系为:
    LA Taq polymerase             0.15 μL
    dNTP                        0.6  μL
    5×GC Buffer                   3  μL
    引物1                       0.6  μL
    引物2                       0.6  μL
    cDNA                        0.6  μL
    ddH2O                        9.5  μL
    Total                         15  μL
    PCR程序如下:
       94℃ 5 min
       94℃ 30s
       58℃ 30s         33 cycles
       72℃ 1min
       72℃ 10 min
    胶回收步骤如下:
    反应结束后,用中孔1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,在紫外灯下用手术刀切下含有目的条带的凝胶,放入2 ml Ep管中,加入400 μL 试剂盒中的溶胶液,55 ℃水浴约10 min,每隔2~3 min翻转混匀,使胶融化;
    待凝胶融化后,将溶液转移到试剂盒中的吸附柱中,室温放置2min使其冷却,用离心机6000 rpm离心1 min,为保证回收率需倒回重复一次,弃掉废液;
  1. 上一篇:外源L-抗坏血酸对Cr6+胁迫下小麦根际pH值和有机酸分泌的影响及其缓解机理研究
  2. 下一篇:水稻不育突变体f287的图位克隆及功能预测
  1. 不同提取方法提取酵母RNA的比较

  2. 利用GENBANK数据库开发黄鳝SSR标记

  3. 酵母质量对发酵过程中无机磷利用影响

  4. 酵母冷冻时间对发酵过程中无机磷利用的影响

  5. 在前导肽引入N-糖基化位点...

  6. 外切葡聚糖酶基因(CBH2)...

  7. 重组马克斯克鲁维酵母产...

  8. 河岸冲刷和泥沙淤积的监测国内外研究现状

  9. 当代大学生慈善意识研究+文献综述

  10. 杂拟谷盗体内共生菌沃尔...

  11. java+mysql车辆管理系统的设计+源代码

  12. 中考体育项目与体育教学合理结合的研究

  13. 电站锅炉暖风器设计任务书

  14. 十二层带中心支撑钢结构...

  15. 乳业同业并购式全产业链...

  16. 大众媒体对公共政策制定的影响

  17. 酸性水汽提装置总汽提塔设计+CAD图纸

  

About

751论文网手机版...

主页:http://www.751com.cn

关闭返回