ABA-胁迫-成熟诱导(ASR)蛋白是一类渗透调节蛋白家族,在逆境胁迫下,其在水稻细胞内的含量会增加,形成单体或二聚体以保护细胞膜结构,参与逆境响应。而ATP合酶广泛分布于线粒体、叶绿体的膜结构上,参与光系统的氧化磷酸化和光合磷酸化,合成ATP为生命活动提供能量。有研究表明,当水稻植株遭遇逆境时,抗逆性强的品种其光合作用仍保持较高水平,ATP合酶表达量在一段时间内降低幅度小[4]。这三个蛋白家族都与水稻耐镉有关系,故将其作为研究对象。
现在各种生化和分子的研究方法发展趋近成熟,如聚合酶链式反应技术(PCR)、琼脂糖凝胶电泳技术、大肠杆菌和酿酒酵母的转化和培养等。大肠杆菌和酵母作为常用的模式生物,是很好的外源基因表达系统,不仅繁殖迅速,易于获得和培养,操作简单,而且可以稳定地复制表达[5],非常适合作为目的基因的扩增和验证工具。本研究以水稻中与耐镉机制相关的基因为研究对象,通过PCR技术扩增得到大量相同片段,连接上pMD19-T载体以后利用大肠杆菌感受态细胞转化得到质粒,经酶切验证后连接到目的载体pYES2上,再利用大肠杆菌,转化得到质粒,转入酿酒酵母中,挑取单菌落培养,得到菌液后配成浓度梯度溶液,在含镉培养基上培养,观察转化子的耐镉情况。
1 材料与方法
1.1 实验材料
基因材料:水稻植株的DNA
感受态细胞及菌株:大肠杆菌E.coli DH5α pMD19-T Vector购自康为世纪生物科技有限公司;酵母菌株Δycf1、yod。
其他试剂:琼脂糖凝胶回收纯化试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司,测序工作交由南京思普金生物科技有限公司,其余试剂和材料均购自国产或进口公司。
主要仪器和设备:PCR仪,离心机,电泳仪,水浴锅,超净工作台,灭菌锅,恒温震荡培养箱。
1.2 实验方法
1.2.1 目的基因的扩增与回收
PCR扩增出目的基因,反应体系为:
LA Taq polymerase 0.15 μL
dNTP 0.6 μL
5×GC Buffer 3 μL
引物1 0.6 μL
引物2 0.6 μL
cDNA 0.6 μL
ddH2O 9.5 μL
Total 15 μL
PCR程序如下:
94℃ 5 min
94℃ 30s
58℃ 30s 33 cycles
72℃ 1min
72℃ 10 min
胶回收步骤如下:
反应结束后,用中孔1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,在紫外灯下用手术刀切下含有目的条带的凝胶,放入2 ml Ep管中,加入400 μL 试剂盒中的溶胶液,55 ℃水浴约10 min,每隔2~3 min翻转混匀,使胶融化;
待凝胶融化后,将溶液转移到试剂盒中的吸附柱中,室温放置2min使其冷却,用离心机6000 rpm离心1 min,为保证回收率需倒回重复一次,弃掉废液;
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