ABC1(activity of bc1 complex)非典型蛋白激酶家族是一个在呼吸作用调节和抗氧化胁迫方面有重要调节功能的多样化蛋白质家族,包含ABC1和AARF两类成员[4,5]。ABC1基因普遍存在于古生菌、细菌和真核生物中,尤其在光合植物中数量最多。进化分析显示,植物ABCl蛋白有两种亚细胞定位:线粒体和叶绿体,它们有着不同的家族起源[5]。在原核生物和真核线粒体中,ABC1激酶调控泛醌的生物合成。在叶绿体和线粒体中,各种复杂的过程相互协调配合,例如光合作用、呼吸作用以及为了适应环境变化所作出的调整。这些生理过程都需要各种蛋白激酶的参与。虽然原核生物和线粒体ABCl蛋白在调控泛醌代谢过程中的作用已得到证明,然而植物ABCl蛋白特别是叶绿体ABCl蛋白的功能还不明确。Manara等[6]报道,拟南芥叶绿体ABC1激酶AtSIA1和AtOSA1调控铁离子分布和氧化胁迫应答。atsia1和atosa1突变体铁蛋白和超氧化物积累增加,植株对氧化胁迫更加敏感,并且叶绿体类异戊二烯的代谢发生改变。然而,Martinis等[7]报道,拟南芥叶绿体质体小球ABC1K3激酶通过磷酸化生育酚合酶(TC)调控维生素E代谢。ABC1K1和ABC1K3激酶能够形成一个复合体,调控类异戊二烯代谢、类囊体重建和胁迫应答[8]。abc1k1、k3及双突变体在高光处理下叶片迅速黄化,然而其抗氧化系统相关酶类和活性氧水平均无显著差异,说明ABC1K1和ABC1K3激酶不参与氧化胁迫的防御。因而叶绿体ABC1激酶可能具有多种不同的功能。
水稻是重要的粮食作物,养活了全世界一半以上的人口。水稻有24条染色体,因基因组小、易于转化,且与其它禾本科作物具有良好的线性关系,所以一直是作物研究的重要模式生物[9]。水稻基因组含有16个ABC1激酶,其中至少7个激酶定位在叶绿体中[4]。然而水稻叶绿体ABC1激酶的分子功能目前仍不明确。本研究利用T-DNA插入突变体对其中ABC1K6的生理功能进行了初步分析,为探明水稻ABC1激酶的准确分子功能及其在基因工程育种中的应用潜力奠定基础。
2 材料与方法
2.1 植物材料与处理
水稻abc1k6突变体来自韩国水稻T-DNA插入突变体数据库(http://signal.salk.edu/cgi-bin/RiceGE),突变体亲本Dongjin作为野生型对照。所有材料于2013年正季种植于淮阴师范学院生物科技园,用于繁殖种子和进行农艺性状调查。
为进行甲基紫精(MV)处理,野生型和突变体的种子播种在盛土的小盆中,并在300 μmol m-2 s-2光照强度的培养箱中培养,培养箱的相关参数设置为:光照时间为14h,湿度是70%,温度是26℃。培养四周以后,对幼苗进行后处理。突变体的幼苗喷洒20 μmol/L的MV和0.1%的Tween 20,而野生型仅仅用0.1%的Tween 20进行处理。处理的频率为一天两次,上午8时处理一次,下午7时处理一次。为避免MV对对照组的影响,先处理对照组,处理完后放置于正常的培养条件下继续培养,培养箱的参数如上所述。
2.2 色素含量的测定
取去除叶脉的叶片0.06g,剪碎后加入20mL80%的丙酮浸泡,因丙酮具有挥发性,所以需要封口处理,然后避光放置48h,中间混匀多次。随后定容至25mL,使用722S分光光度计(上海仪电科学仪器股份有限公司),分别测定663nm、645nm、470nm波长下的色素吸光度,以80%的丙酮溶液作为空白,利用Arnon公式计算色素含量: