响应面法优化黑曲霉产纤维素酶的培养条件(2)

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1.1 材料

1.1.1 供试菌种

黑曲霉130911，淮阴师范学院实验室保藏

1.1.2 主要仪器

超净工作台，恒温水浴锅，台式离心机，天平，紫外分光光度计，立式灭菌锅

1.1.3 培养基

斜面培养基[12]:马铃薯 20g,葡萄糖 2g,琼脂 2g,PH自然

种子培养基：PDA培养基

发酵培养基[13]：液体发酵培养基( 质量分数) : 碳源5%、氮源1%、KH2PO4 0. 05%、Mg SO47H2O 0. 05%。

将上述所有培养基均在1.0×10 Pa、121 ℃灭菌30min。

1.2 方法

1.2.1 培养方法

种子活化：将接种后的斜面于培养28 ℃ 4- 5 d。种子培养:250mL三角瓶装入种子培养基 50mL，接入菌种三环, 转速 150r/min,30℃下振荡培养 72h～168h;发酵培养:按 5%～10%接种量接28℃～32℃培养 60h～96h,测定酶活。

1.2.2 酶液制备

发酵液先由无菌纱布过滤,再经 4500r/min,10min离心,上清液用缓冲液做适当稀释。

1.2.3 DNS试剂配制

按照参考文献[15]的方法：取6.3g 3,5-二硝基水杨酸和262ml浓度为2mol/L的NaOH溶液加到500ml含有182g酒石酸钠的热水溶液中，再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中，7d 后使用。

1.2.4 酶活测定

标准葡萄糖曲线的制作[14]：取7 支干净的试管，分别加入1mg/ml 标准葡萄糖溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2,1.4,1.6.1.8.2.0，然后定容到2ml，再各加入DNS溶液3ml，置于沸水浴中煮沸5min，冷却后加蒸馏水10ml，摇匀，波长540nm 处测定光密度吸收值，并用葡萄糖含量(mg)与吸收值(OD 值)作图，即为标准曲线。