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2.7 重组精氨酸脱亚氨基酶在大肠杆菌BL21中的表达 12
2.8 重组ADI包涵体的分离纯 13
2.8.1 包涵体洗涤 13
2.8.2 包涵体的变性 13
2.8.3 重组ADI的复性 13
2.9 游离态精氨酸脱亚氨基酶的分离纯化 14
2.9.1 硫酸铵分级沉淀 14
2.9.2 透析脱盐 15
2.9.3 离子交换层析 15
3 结果和分析 15
3.1 ADI 酶活性标准曲线及Bradford 标准曲线 15
3.2 重组ADI在大肠杆菌BL21中的表达 16
3.3 重组ADI的变性及复性 17
3.4 游离ADI的分离纯化 18
4 试验讨论 19
4.1 超声破壁 19
4.2 包涵体洗涤 20
4.3 重组ADI包涵体的变性及复性 20
4.4 游离态的重组ADI分离纯化 21
结 论 22
致 谢 23
参 考 文 献 24
1 引言
1.1 精氨酸脱亚氨基酶（arginine deiminase,ADI)简介
1.1.1 精氨酸脱亚氨基酶的生物学意义
精氨酸脱亚胺酶(Arginine deiminase，ADI)作为一种精氨酸降解酶，不可逆催化精氨酸生成瓜氨酸和氨。ADI最早由F.Horn [1]于1933年在绿脓杆菌细胞中发现。后来科学家也在其他微生物，如假单胞菌[2]，支原体[3]，盐杆菌[4]，乳球菌[5]等中发现ADI的存在。但到目前为止，在高等真核生物细胞中却还没发现ADI。论文网
精氨酸脱亚胺酶负责催化ADI途径中第一步反应。该途径含有三种酶：精氨酸脱亚胺酶（ADI,催化精氨酸转化成瓜氨酸和氨）、鸟氨酸转氨甲酰酶（OTC，催还瓜氨酸生成鸟氨酸和甲酰磷酸）、氨基甲酸盐激酶（CK，催化使甲酰磷酸变成氨和二氧化碳）。ADI途径中每分解一分子精氨酸可产生一分子ATP。所以一些微生物，如支原体、恶臭假单胞菌、乳球菌、粪肠球菌等利用精氨酸作为主要能量来源。
精氨酸脱亚氨基酶的理化性质
七十年代，T.Shibatani等人，通过超声波破碎、硫胺沉淀、鱼精蛋白处理、DEAE纤维素柱层析、L一精氨酸亲和层析于恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putida)中提取到精氨酸脱亚胺酶。SDS电泳法测得分子量为54000，等电点为6.13，该ADI的比酶活为58.8 U/mg酶蛋白，最适pH为6.0，最适酶反应温度为50℃，紫外光谱显示酶的最大吸收峰在280 nm处[6]。
文献报道，来源于支原体（Mycoplasma arginini）的ADI，分子量为80000，等电点为7.0，紫外光谱显示酶的最大吸收峰在278 nm处。该酶与L-精氨酸有很高的亲和力，在反应温度25℃，pH 7.2时，Km为4±1 mM[7]。来~自^751论+文.网www.751com.cn/
不同来源的ADI，其氨基酸组成、酶学性质有着较大的区别。表1-1[8]所示，其比酶活范围从21.7-140.3 U/mg，分子量从49ku-190ku不等，其最适pH值范围在5.6-7.2。其中来自 Mycoplasma arginini 和 Pseudomonas plecoglossicida 的 ADI氨基酸同源性只有27.1%。虽然不同来源ADI的性质有所差异，氨基酸组成相差较大，但其相似的三维空间结构可能是这些不同来源的ADI具有相近分解精氨酸能力的重要原因。来自 Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas plecoglossicida、Lactococcus lactis和Mycoplasma arginini 的ADI 都具有相同的Cys-His-Glu催化中心。