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双人单面垂直洁净工作台 （上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；
电热恒温培养箱 （上海一恒科学仪器有限公司）；
气浴恒温振荡器 （THZ-82A型 江苏省金坛市医疗仪器厂）；
紫外722型可见分光光度 （上海光谱仪器有限公司）；
显微镜CX21FS1 （OLYMPUS型）；
实验室pH计 （EL20型 梅特勒托利多仪器（上海）有限公司）；
电子天平 （AL204型 梅特勒托利多仪器（上海）有限公司）； 碱式滴定管
2 实验方法
21 乳酸菌的初筛及鉴定
211 乳酸菌的筛选
在无菌环境中，称取3g老酸奶发酵剂于装有27mL无菌水的锥形瓶中，震荡摇匀，用移液枪吸取1mL，加入到装有9mL无菌水的试管中，依次稀释到10-8，编号为第①组；在同样条件下取1mL花花牛酸奶，加入到装有9mL无菌水的试管中，同样依次稀释到10-8，编号为第②组。对①②两组样品分别选择10-6，10-7，10-8三个稀释度[10]，采用平板涂布法，将稀释液均匀涂布于MRS固体培养基上，然后将培养基放置在37℃恒温条件下[11]培养48h。
212 乳酸菌的鉴定
首先对MRS培养基培养出的乳酸菌进行菌落形态的观察。观察其菌落的颜色、大小、表面特征、隆起度等特征。然后选取培养基中长势较好的三种乳酸菌，用MC培养基划线分离培养[12,13]，观察培养出的菌落周围是否有溶钙圈。然后对乳酸菌的菌株进行观察，采用革兰氏染色法，染色后在显微镜下进行观察。最后进行酸奶发酵实验，观察酸奶的颜色、凝乳情况、组织状态等[14]。
22 菌株的扩大培养
在无菌环境中，从平板中选择三种长势较好的菌株（其中两种选自老酸奶发酵剂样品，分别命名为R1，R2；本文来自751\文/论~文?网，毕业论文 www.751com.cn另一种选自花花牛酸奶样品，命名为R3），用接种环挑取菌体接种到MRS液体培养基中，将培养基置于37℃恒温振荡条件下培养。
23 三种菌株生长曲线的绘制
在相同条件下，每隔2h对三种菌株的培养液取样，分别测定其OD660值，绘制20h内三种乳酸菌的生长曲线。
24 标准曲线的制备
考马斯亮蓝试剂：准确称量考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50mL 95%乙醇中，加入100mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL，滤纸过滤。最终试剂中含001% (W/V)考马斯亮蓝G-250，47%(W/V)乙醇，85%(W/V)磷酸。
取7支干净试管，按表1进行编号并加入试剂。然后，振荡试管使以上加入的各试剂混匀。室温静置3min后，以第1管为空白，于波长595nm处比色，读取吸光度，以吸光度为纵坐标，各标准液浓度（ug/mL）为横坐标作图得出标准曲线。
表 1 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度-制备标准曲线
试剂
管号 1（空白） 2 3 4 5 6 7
标准蛋白液/mL - 01 02 03 04 06 08
09%NaCl/mL 10 09 08 07 06 04 02