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1.3.3 AFLP技术流程
AFLP 反应程序主要包括模板DNA 制备, 酶切片段扩增及凝胶电泳分析3 个步骤。
（1）模板DNA 制备 DNA 的酶切以及与人工合成的寡聚核苷酸接头连接。在进行AFLP 分析时, 首先要制备高分子量基因组DNA, 然后用限制性内切酶酶切。 为了使酶切片段大小分布均匀, 一般采用双酶酶切 , DNA 酶切完成后, 经加热使限制性内切酶失活, 再把酶切片段连结到特定的接头上, 形成扩增反应的模板。
（2）选择性扩增酶切片段 一般酶切片段要经过连续2次PCR扩增。第1次PCR 扩增为预扩增, 一般用带1个选择性碱基的引物进行, 第2次为选择性扩增, 即预扩增反应的产物经过大量稀释后用作第2次扩增反应, 所用引物3´端有3 个选择性碱基。经两步扩增反应使产生的扩增结果更清楚。
（3）扩增产物的凝胶电泳分析 选择性扩增产物一般在5%～ 6% 的变性聚丙烯酰胺凝胶上经过电泳分离, 形成DNA 指纹, 凝胶经过干燥、放射性自显影后进行相应的产物检测。目前最常用的方法是银染检测法。
1.3.4 AFLP技术优缺点
近年来分子标记技术取得了很大进展，从第一代的RFLP产生到现在已经有十几种分子标记技术相继问世，与其他分子标记技术相比，AFLP的优越性主要表现在：
（1）样品用量少, 检测效率高 AFLP 检测所需要的样品DNA 量较少, 通常为0. 5μg。Ervera 等仅利用2个AFLP 引物组合就揭示了从西班牙收集到的67 个不同葡萄样品间的遗传相似性。
(2)多态性高 在任何情况下, PCR 扩增都会产生大量反映生物个体内变异或非变异的条带。AFLP 标记具有比RFLP、RAPD 标记经济、有效、可靠地揭示物种多态性水平的特点。AFLP 标记与RFLP、RAPD 标记进行了比较, 鉴别多态的功能顺序是A FLP> RAPD > RFLP,AFLP 是DNA 多态性检测的一项重要技术。
(3) 可靠性好, 重复性高 PCR 反应中较高的退火温度和较长的引物可将扩增反应中的错误减少, 使假阳性降低, 可靠性增强。不断重复的AFLP反应显示出了其近乎完美的可重复性。Jones 等研究表明, 在欧洲8 个不同实验室对同种材料进行AFLP 标记分析, 其误差小于0.6%, 与微卫星标记的效果相近。
(4) 对模板浓度的变化不敏感 模板浓度在相差1000 倍的范围内可得到基本一致的结果。只是模板浓度很低时, 谱带强度较弱, 有谱带发生缺失。
(5) 操作相对简便且样品适应性广 AFLP 技术不需要Southern 杂交, 不需要制备探针, 且不需要预先知道被分析基因组DNA 的序列信息, 操作较简单, 易于标准化和自动化。A FLP 技术适用于任何来源和各种复杂度的DNA, 如基因组DNA、cDNA、质粒、某一个基因或基因片段, 且不需要预知这些DNA 的序列特征。用同样一套限制酶、接头和引物, 可对各种生物的DNA 进行分子遗传标记研究。
(6) 稳定的遗传性 AFLP 标记在后代中的遗传和分离中符合Mendel 式遗传规律, 种群中的AFLP 标记位点遵循Hardy-Weinberg 平衡。
(7) 分辨率高 理论上A FLP 可产生无限多的标记数并可覆盖整个基因组, 其中至少一些的标记会存在变异区域, 因此可以揭示任何生物有机体的十分细微的遗传差异。
（8） AFLP易于标准化和自动化，适合大批量样品分析。随着检测技术的不断提高，同位素标记已经不再是AFLP的唯一检测方式，银染技术、荧光标记、地高辛标记相继出现，大大降低了同位素的危害性，同时荧光标记技术也由单纯标记引物转变为标记dNTP。Bachem等于1996年将AFLP技术应用于mRNA差异分析，发展成为一种mRNA指纹图谱技术，即cDNA-AFLP技术[10-13]
虽然AFLP 具有多态性丰富、灵敏度高、稳定性好、可靠性高、不易受环境影响等优点, 但也存在着一些缺点, 如由于AFLP 技术所用试剂昂贵。 AFLP 分析需要同位素或非同位素标记引物, 因此在操作过程中必须具有特殊的防护措施以及配套的仪器设备。AFLP 对DNA 纯度和内切酶的质量要求较高, 基因组DNA 酶切不完全会影响试验结果等。同时AFLP 也存在着对模板反应迟钝、谱带可能发生错配与缺失等一系列问题。此外, AFLP 作为一项专利技术, 受到专利权保护, 使用成本比较高, 还有资料表明, 该方法在鉴别同源标记即等位基因时还有一定的难度, 在对等位基因的精确定位中存在一定的局限性。
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