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摘 要：建立了采用双菌生物转化RSA(17α-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯)制备氢化可的松的制备方法。通过培养发酵蓝色犁头霉菌和新月弯孢霉菌，转化RSA，通过乙酸丁酯萃取，在经过水洗提纯方法后，采用C18色谱柱为液相分离柱，以85:15的乙腈和水为流动相，梯度洗脱，进行含量测定。产物氢化可的松的线性回归方程为Y= 35713X -64.90，相关系数：R2= 0.999。22758
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毕业论文关键词：氢化可的松；蓝色犁头霉；新月弯孢霉；RSA
Study of hydrocortisone from RSA by bio-transformation
Abstract: Paper adopt cooperative-mycelia system of twin strains of Absidia coerulea AS3.65 and Curvularia lunata AS3.4381 to bio-transform RSA to hydrocortisone. After extraction by butyl acetate and purification of water washing several times, C18 chromatographic column as liquid phase separation column is adopted to assay hydrocortisone. The mobile phase A is water and mobile phase B is acetonitrile. The proportion of mobile phase A to B is 15 to 85 under gradient elute. The hydrocortisone of equation of linear regression is Y= 35713X -64.90, coefficient of association is R2= 0.999.
Keywords: hydrocortisone, Absidia coerulea AS3.65, Curvularia lunata AS3.4381, RSA
目录
1. 研究背景•1
1.1 甾体的生物转化1
1.2 氢化可的松的简介•1
1.3 菌种介绍•2
1.3.1 蓝色犁头霉菌简介2
1.3.2 新月弯孢霉菌简介3
1.4 氢化可的松国内外制备方法•4
1.5 甾体C11β-羟基化生物化学反应的机理•5
1.6具有对甾体进行C11β-羟基化能力的菌种选择•5
1.7 微生物甾体C11β-羟基化过程中副产物的问题•5
1.8氢化可的松的检测方法6
1.8.1紫外吸收光谱•6
1.8.2 高效液相色谱法•7
1.9 本课题的研究意义及研究内容7
1.9.1 研究意义7
1.9.2 研究内容7
2．实验材料及方法•9
2.1 实验材料•9
2.1.1 原始菌株9
2.1.2 主要试剂9
2.1.3 主要仪器•10
2.2 实验条件的研究•10
2.2.1 流动相的研究•11
2.2.2 标准曲线的绘制11
2.2.3 蓝色犁头霉菌和新月弯孢霉菌的孢子培养基研究12
2.2.4 蓝色犁头霉菌发酵培养研究•12
2.2.5 蓝色犁头霉发酵转化RSA的助溶剂选取12
（1） 无助溶剂，无水乙醇，1,3-丙二醇，吐温-80对比•12
（2） 投料量与吐温-80对转化率的比较•13
2.2.6 新月弯孢霉的发酵培养•13
2.2.7 双菌转化RSA制备氢化可的松13
2.2.8 高效液相色谱法测定转化率•14
2.2.9 提取步骤•14
2.3 结果的计算和表达14
3．实验结果与讨论15
3.1 仪器的确认•15
3.2 标准曲线的绘制•17
3.3 蓝色犁头霉和新月弯孢霉的孢子培养基的确认18
3.4 蓝色犁头霉发酵培养•19
3.5 蓝色犁头霉发酵转化底物RSA的助溶剂选取22
3.6 新月弯孢霉生长曲线的观察25
3.7 双菌转化RSA制备氢化可的松28
3.8 高效液相色谱法测定双菌最终反映制得HC的转化率28
3.9 含量测定•29
4 结论•30
参考文献31
致谢33
1 研究背景
1.1甾体的生物转化
对于一般的氨基酸和抗菌素，其发酵转化是依靠微生物的代谢产物，而甾体的微生物转化则完全不同，它们是运用微生物的酶来对甾体底物的某一个部位进行特定的化学反应，从而得到特定的产物。换而言之，生物转化就是利用已经培养成熟的生物细胞或者从已成熟的生物细胞中提取酶来对底物的某一特定的部位或基团来进行化学反应，继而使所作用的底物转化为与其本身具有类似结构的另一种化合物。所以甾体类物质和其他生物物质本质还是一样，微生物可以使其最终分解为水和二氧化碳。微生物转化甾体物质的通式过程[1]，如图1所示。