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摘要：分子伴侣是一类可与其它蛋白质结合并稳定其构象，但自身并不发生任何变化的一大类广泛存在于生物体内的蛋白质分子。通过与蛋白质的结合和释放，分子伴侣可以促进细胞内蛋白质的正确折叠、跨膜转运、寡聚体组装，还可以调控蛋白与细胞内其它组分的相互作用、蛋白活性构相、胞内转运以及蛋白质的降解。本研究克隆了四种分子伴侣肽基脯氨酰顺反异构酶（peptidyl-prolyl cis-trans isomerase (PPIase)，SurA）、FKBP 型肽基 - 脯氨酰顺反异构酶（旋转异构酶）(FKBP-typepeptidyl-prolyl cis-trans isomerase (rotamase)， FkpA)、 肽基脯氨酰顺式反式异构酶 A （旋转异构酶 A）（ peptidyl-prolyl cis-trans isomerase A (rotamase A),RotA）和丝氨酸内切蛋白酶（蛋白酶 Do）（serine endoprotease (protease Do)、DegP），分别构建了这 4 种分子伴侣的原核表达重组质粒，并在大肠杆菌中诱导表达。蛋白电泳及蛋白印迹结果表明 SurA、FkpA、RotA 这 3个分子伴侣均可以在大肠杆菌表达系统中成功表达，本研究为可溶性原核表达系统的构建奠定基础。37978
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毕业论文关键词：分子伴侣；蛋白质折叠；可溶性表达；
Cloning and expression of E.coli periplasmic chaperonesAbstract:Molecular chaperones are a serial group of proteins which are found in all living organisms, involved in the process of the folding, assembly, transportation and degradation of intracellularproteins,but remaining themselves unchanged when they are working.In this study,four molecular chaperones,SurA、FkpA、RotA and DegP were cloned,and the recombinant plasmids of these four chaperones were constructed and expressed in Escherichia coli.The results of protein electrophoresisand Western blot showed that SurA, FkpA and RotA could be successfully expressed in Escherichia coli expression system. This study laid the foundation for the construction of soluble prokaryoticexpression system.
.Key words:molecular chaperones;soluble expression; protein folding
目 录
摘要.2
关键词.2
Abstract.2
Key words.2
引言.2
1 材料与方法.4
1.1 材料4
1.1.1 质粒与菌株4
1.1.2 培养基.4
1.1.3 试剂4
1.1.4 主要溶液5
1.1.5 实验仪器.5
1.2 实验方法.6
1.2.1 引物设计6
1.2.2 大肠杆菌基因组的提取.6
1.2.3 目的基因的扩增.7
1.2.4 目的基因的回收.7
1.2.5 酶切载体及目的基因7
1.2.6 重组质粒的构建.8
1.2.7 连接产物转化.8
1.2.8 重组质粒鉴定.8
1.2.9 目的基因蛋白表达.10
1.2.10 分析方法.10
2 结果与分析.11
2.1 目的基因扩增.11
2.2 重组质粒鉴定.12
2.2.1 PCR 反应12
2.2.2 双酶切鉴定.13
2.3 分子伴侣基因的表达14
2.3.1 SDS-PAGE 蛋白电泳结果14
2.3.2 western-blot 蛋白印迹结果15
3 讨论.16
致谢.16
参考文献.17
引言自提出 DNA双螺旋结构和中心法则以来，生物学便进入分子生物学时代。分子生物学的每一步发展都可以看做对中心法则的进一步探索，这其中最主要也是最复杂的部分就是遗传信息是如何从无结构的多肽链到有完整空间结构的功能蛋白的传递的过程，即第二遗传密码的研究[1]。在相当长的时间内，根据 Anfinsen 开展的蛋白质体外复性实验,蛋白质折叠被认为是自发进行的，但这一理论并不能解释所有问题[2]。直至上世纪 80年代，分子伴侣的概念彻底改变了人们对蛋白质折叠过程的认识，使人们意识到绝大多数蛋白质都需要分子伴侣和代谢能来实现有效快速折叠。分子伴侣（molecularchaperone）的概念是由 Lasky 在 1978 年首先提出的，他将细胞核内能与组蛋白结合并介导核小体有序组装的核质素(nucleoplasmin)称为分子伴侣[3]。经过几十年的发展，分子伴侣的概念已经扩大为：在生物大分子的折叠、组装、转运及降解等过程中起协助作用，参与协助抗原的呈递和遗传物质的复制、转录及构象的确立；参与细胞周期调控、抗衰老、凋亡调控等，但自身并不发生任何变化的一大类广泛存在于生物体内的蛋白质分子[4]。大肠杆菌表达系统是实验室广泛应用的用于表达异源重组蛋白的表达系统，具有遗传背景清楚，增殖速度快，目的基因表达量高等优点[5]。但由于大肠杆菌自身缺少一些辅助蛋白质正确折叠的酶，因此许多蛋白尤其是结构复杂和富含二硫键的蛋白容易发生错误折叠，形成包涵体[6]。包涵体是蛋白质错误折叠形成的产物，不具有生物活性，应用价值不大。目前，多种方法可用于提高外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达，如表达分子伴侣、 融合表达、定位表达、改善诱导条件、添加促折叠试剂、选择宿主细胞等[7]。其中，共表达分子伴侣由于对蛋白的折叠较为有效，纯化的外源蛋白不需要除去融合标签等优点而受到重视，因此具有广阔的应用前景。