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2.2 药用植物大戟kao基因的克隆与序列分析 7
2.3 药用植物大戟kao基因的组织特异表达 11
3 讨论 11
4 致谢 12
参考文献 13
引言
京大戟别名又叫大戟或龙虎草等，是大戟科大戟属植物大戟(Euphorbia pekinensis Rupr)的干燥根，京大戟性寒、味苦、有毒，最初在《神农本草经》作为药材，中医中经常用来峻下逐水药，功效泄水逐饮，消肿散结[1]。临床上可以用来治疗胸膜炎积水,晚期血吸虫病腹水,肝硬化腹水及精神分裂症等[2]。目前对京大戟的化学成分[3]和药理作用已经具有一定的研究基础，从京大戟中分离到了多种结构复杂的化合物，药理研究发现京大戟中分离的化合物具有抗肿瘤、抗白血病[4]、镇痛、消炎[5]等作用。临床研究发现京大戟具有治疗精神分裂症[6]、肝硬化腹水、便秘[7]、耕牛前胃弛缓[8]等疗效。但京大戟具有毒性[9]，限制了京大戟的应用。京大戟的毒性成分大部分为二萜类化合物[10]。在大戟属植物中普遍含有大戟二萜类成分, 其结构特殊、新颖, 是生物活性的主要成分, 生理活性会因大戟二萜类成分的不同碳骨架类型产生明显差异性。目前国内外学者已从大戟属植物中分离得到50余种碳骨架结构类型的二萜类成分。研究表明其中四环二萜（巴豆烷型与巨大戟烷型）和三环二萜（瑞香烷型）以及大环二萜类成分为主要具有毒性的化合物。
细胞色素P450(cytochromeP450)关键的作用是促进有机化合物的氧化还原反应。单加氧酶超家族[11]是细胞色素P450的大家族，因为其蛋白催化的最关键反应是单加氧酶反应，单加氧酶蛋白P450也被叫作细胞色素P450。细胞色素P450以两种形式存在于自然界中来催化氧化还原反应，分别为单体形式和二聚体形式。在生命体中，线粒体内膜，真核生物的内质网，植物的叶绿体，光合反应的微生物，还有细菌为细胞色素P450具体分布场所。CYP450参与了植物中多种结构产物，特别是多结构类型的萜类化合物的合成。
植物CYP450 的功能主要可归为两大类:：1）参与生物合成途径 ；2）参与生物解毒途径[12-13]。参与生物合成途径的植物CYP450在苯丙烷类、生物碱 、萜类、植物激素等的合成中起重要作用。如二萜类药物紫杉醇的生物合成过程中就有多个CYP450酶的参与。药用植物大戟的根京大戟是一种民间常用药材，研究表明其有双重生理活性，既有抗菌，抗病毒和抗肿瘤等生理活性，又有致毒作用，这种双重生理活性与其所含有的二萜结构类型密切相关，细胞色素P450(CYP450)参与了萜类多样性结构的形成，因此克隆大戟二萜类生物合成中参与的CYP450基因并进行功能分析具有重要意义。
本研究克隆了药用植物大戟二萜类合成途径中的一个CYP450基因--贝壳杉烯酸氧化酶（ent-kaurenoic acid oxidase, KAO）基因，并对该基因进行了生物信息分析，对药用植物大戟根茎叶组织中的kao基因的表达差异也进行分析，探讨药用植物大戟二萜类成分与kao基因表达量的关系，为进一步揭示药用植物大戟毒性物质合成机制提供理论依据，并为利用基因工程提高中药材品质奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
实验所用植物大戟取自江苏师范大学后山。经ITS序列鉴定为药用植物大戟。
1.2 主要试剂
植物RNA提取试剂盒从天根生物科技有限公司购买获得，反转录试剂盒从宝生物（大连）有限公司采购、高保真酶从南京诺唯赞生物科技有限公司采购、质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、DNA连接试剂盒从Transgen生物科技有限公司采购。