2.3夹心ELISA检测    13
2.4间接免疫荧光试验检测    14
2.5重组病毒rHVT-VP2-C3d株的遗传稳定性    14
2.6重组病毒与野生病毒在CEF上的生长曲线比较    14
3.讨论    15
致谢：    16
参考文献：    16
附录    18
表达IBDV VP2和鸡C3d基因重组火鸡疱疹病毒的构建
引言
传染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease, IBD）又称为冈博罗病，是由传染性法氏囊病病毒（Infectious Bursal Disease Virus, IBDV）引起的一种急性、高接触性传染病，3 ~ 6周龄的鸡易感。该病一方面可以导致免疫抑制，另一方面会使发病鸡群死亡 率、淘汰率增加[1]，给全球养禽业造成了巨大的经济损失。
传染性法氏囊病毒（IBDV）属于双RNA病毒科双RNA病毒属，是一种的无包膜的病毒，直径约为55 ~ 65 nm。该病毒主要侵害鸡的法氏囊内未成熟的B淋巴细胞以及B淋巴细胞的前体细胞[2]，导致幼鸡法氏囊B淋巴细胞坏死从而无法发挥其免疫功能。该病毒还可感染鸡巨噬细胞，使细胞死亡或功能紊乱。IBDV基因组包括大（A）小（B）两个双链RNA片段，VP1是由B片段编码的一种依赖RNA的RNA聚合酶，是病毒的非结构蛋白，并且VP1与病毒RNA的复制和毒力大小有关[3-5]。VP2是由IBDV A片段的VP2基因编码，分子量为41 kDa，其占病毒蛋白的51％，VP2是传染性法氏囊病毒的主要结构 蛋白，并且是宿主的主要保护性抗原[6]。目前为止，IBD基因工程疫苗的研究大都以VP2为目的基因，采用的表达系统包括：大肠杆菌表达系统[7]、酵母表达系统[8]、鸡痘病毒载体表达系统[9]、杆状病毒载体表达系统[10]、核酸疫苗表达系统[11]以及多表位疫苗表达系统[12]等，但是在这些研究中也存在一些问题，例如：重组蛋白复性困难，表达量低等。因此，在VP2基因的选择、表达系统以及表达策略方面需要进一步探索新的技术路线。
C3d片段是补体C3分子在C3转化酶的作用下通过补体反应的三条途径，在α链的N端77位氨基酸处裂解而来，被认为是一种新型的分子佐剂[13]。补体C3分子是补体系统的中心部分，在宿主防御机制中处于枢纽地位，除此之外，其还具有广泛的生物免疫学功能。已结合抗原的C3d片段可以和CD 21在成熟的B细胞表面以非共价键的形式结合，使膜蛋白CD 19与CD 21相连，通过共受体中的CD 19向胞内传递信号，显著降低了B细胞的活化阈值，能使刺激B细胞活化所需抗原的浓度大幅度下降[14-15]。目前为止，国内外的大量的研究表明C3d片段具有分子佐剂的作用，但如何将C3d片段开发为高效的分子佐剂并应用于实际生产，还有待进一步的研究[16-19]。
二十世纪751十年代末，从火鸡体内分离出的火鸡疱疹病毒（Herpesvirus of turkey，HVT）是一种α疱疹病毒，基因组序列大小约为160 kb，是血清型Ⅲ型马立克病毒，对鸡和其他动物无致病作用，常作为病毒载体来构建病毒载体活疫苗。HVT疫苗作为首例预防马立克氏病（MD）的疫苗，取得了良好的使用效果，大大减少了家禽业由于MD而造成的损失，至今仍然被广泛应用，具有重要的价值。另外近些年来，以HVT作为基因工程疫苗的载体已成为国内外学者研究的热点，并且多种致病性保护性抗原基因在其中得到高效表达，免疫效果良好，因此以HVT作为基因工程疫苗的载体是非常具有研究前景的[20-24]。
1987年以后，超强型传染性法氏囊病毒（vv IBDV）逐渐在亚洲和欧洲等地出现，导致IBD的抗原特性、发病率、流行的地域性、死亡率、病理剖检等方面都发生了较大的变化，经典毒株所产生的抗体并不能彻底中和这些变异毒株，甚至这些变异毒株可以打破幼鸡母源抗体的庇护[25]。近年来，在我国多个省（区）流行的主要为vv IBDV毒株，而且所有被分离到的VP2基因高变区都缺乏显著的时间和地域的遗传特性[26]。一方面，超强毒株和变异毒株的出现使该病的预防和控制增添了不少难度；另一方面，常规弱毒疫苗和灭活疫苗在安全性和制造工艺方面存在着些许不足。是以，当前迫切需要免疫效果优良，高生物安全性，以及针对目前流行超强毒株的IBD基因工程疫苗被研制出来。 表达IBDVVP2和鸡C3d基因重组火鸡疱疹病病毒的构建(2):http://www.751com.cn/yixue/lunwen_23226.html