超速离心前，血浆水中的药物浓度应当和血浆中初始的总药物浓度相等。

    该方法的优点是克服了Gibbs-Donna效应和膜吸附等与透析膜相关的缺陷。与平衡透析法相比，该方法的物理现象如沉降，反向扩散和粘度影响游离药物浓度的准确定量，从而限制了该方法的应用。

（4） 高效亲和色谱法

高效亲和色谱法是近年来用于药物蛋白结合的新技术。高效亲和色谱法使用一种HSA色谱分析柱，与紫外线与质谱检测结合，来测定血浆蛋白结合度[26]。这种柱如商品化的固化白蛋白，能用于区分不同位点的结合度，如HSA手性固定相Hypersil（Runcorn, UK）。该方法可以用于化合物单峰分析和多峰的（＞90%结合）的化合物分析。当血浆蛋白结合度＞90%的化合物的多峰分析不会引起柱的超载，其药物浓度可达100μg/mL。然而，HSA柱模型作为一种HTS装置来整体使用看来是有限的。

高效亲和色谱法是基于检测药物的保留和竞争，当它们通过一根固定的HSA柱，在这根柱子里带状淋洗和前沿亲和色谱或者两者的结合常被用在检测各种药物的结合常数。因为与其他传统方法相比，它具有高精度，自动化，高速以及良好的相关性等显著优点[27]。来!自~751论-文|网www.751com.cn

实验中使用磷酸钾缓冲溶液KPB，KPB能适用于不同浓度的各种药物。速率保持在0.5mL/min，适合于在HSA柱中建立局部平衡。当化合物将被洗脱时，柱子可以通过使用KPB清洗来获得再生。柱子饱和的药物的数量决定了结果突破曲线的平均位置。   

其中mL与柱上结合位点的真实数目有关，mLapp是溶质需要达到突破曲线的中间点的表观摩尔。Ka是药物与HSA结合的平衡常数，[A]是用于柱子的药物浓度。

竞争洗脱法通常在1.0mL/min（4.6mm I.D.柱）或0.2mL/min（2.1mm I.D.柱）下进行。化合物的浓度范围从1.0到3.0μmol/L，能避免由过载导致的滞留因子发生显著变化。平均保留时间通过计算每一峰的统计动差来得到（等式（7））。柱无效时间通过注射硝酸钠作为一种非保留溶质来求得