①同时把1.5 g的碳酸氢钠，0.33 g的谷氨酸和一包DMEM粉末溶于适量三蒸水中，并摇匀，再用容量瓶定容到1L；

    ②再将培养基的pH用稀盐酸调节到7.2；

    ③放在4℃ 的条件下，静置过夜；

④用二蒸水和三蒸水先后把滤器清洗烘干；

⑥再放在121℃ 温度下灭菌30分钟，以备用；

    ⑤用滤器过滤培养基，分别装到无菌100 mL的玻璃瓶当中，每瓶装90mL,保存在4℃温度下，以备用。

1.3.2细胞培养

①将SD大鼠（新生24小时内）浸泡在配置好的 75% 无水乙醇中，浸泡 5-10 分钟；

②用眼科剪剪下头部，用镊子和剪头小心分离新生鼠的头盖骨；

③用PBS缓冲液冲洗、小心去除新生鼠头盖骨上的软组织；

④去除后再用PBS缓冲液冲洗干净；

⑤将新生鼠头盖骨放置在血清中，并剪碎为 1 mm × 1 mm 的小块；

⑥再将小块转移至培养瓶中，加入 5ml DMEM 高糖培养基； 

⑦将骨片均匀的分散，使骨片的一面向上，置于体积分数5% CO2、37℃的CO2培养箱中倒置培养； 

    ⑧过夜后将培养瓶翻面使骨片浸润在培养液中，之后每 2-3天换液；

⑨细胞传至第三代时，取出用于本次实验。文献综述

1.3.3成骨细胞ALP染色的鉴定

     取第3代生长状态良好细胞做染色鉴定，因为碱性磷酸酶（ALP）是成骨细胞前期分化的特殊标志[12]。所以通过碱性磷酸酶染色来鉴定成骨细胞的纯度。

步骤如下所示：

   ①将第3代细胞固定后，用适量的洗涤液洗涤3-5分钟，再重复洗3-5次；

   ②按下面参数比例，配制BCIP/NBT染色工作液：

碱性磷酸酯酶显色缓冲液 3ml 10ml 

BCIP溶液(300X) 10μl 33μl 

NBT溶液(150X) 20μl 66μl 

BCIP/NBT染色工作液 3.03ml 10.1ml 

   ③ 洗涤完之后，吸弃洗涤液，加入BCIP/NBT染色工作液，使细胞充分的覆盖；

   ④ 在室温避光的条件下，培养一段时间，直到显色为预期深浅的颜色；

   ⑤ 吸弃BCIP/NBT染色工作液，再用蒸馏水重复洗涤2次，终止显色反应；

   ⑥ 最后，利用相差显微镜观察。

1.3.4实验分组

   将第3代细胞接种后分成两组：实验组和对照组，实验组给予含辛伐他汀（1×10-7 mol/L）的完全培养液，对照组给予含等量溶剂无水乙醇的完全培养液进行干预，并在相同的条件下进行培养。               

    a.培养1天后取出分别进行细胞的形态观察；来!自~751论-文|网www.751com.cn

    b.分别培养4和7天时对其碱性磷酸酶活性的定量测定。

1.3.5 细胞形态观察（染色）

    ①将细胞（密度2×104 cells/cm2 ）接种于24孔板中，培养2天后，用PBS缓冲液清洗2分钟,再重复清洗2次；

    ②用2%戊二醛在4℃ 条件下固定20分钟后，然后用PBS缓冲液清洗2分钟,再重复清洗2次；

    ③用0.2%Triton X-100在4℃ 条件下透膜处理2分钟，再用PBS缓冲液重复冲洗3次；