Bgl Ⅱ 0.5 ul
质粒 8.0 ul
双蒸水 9.0 ul
总体积 20.0 ul
②先准备一个冰盒并放入一定量的冰块。从-20℃冰柜中取出限制性内切酶,立即插入冰块中。
③用一只手的手指捏在盛放酶的微量离心管的上部(以免手指的给酶液加温),另一只手持微量移液器,小心翼翼地吸取0.5 μL限制性内切酶。
④在酶切样品混合液中加入限制性内切酶后(立即把内切酶原液送回冰柜!),轻轻震动微量离心管使管中的溶液混匀。取出后插到水漂的孔中,在推荐的最适酶切温度水浴中37℃温育4 h。
⑤酶切后取少量酶切产物与DL2000DNA分子量Marker,λHindIIIDNA分子量Marker对比电泳,以确认切下的片断是否为自己想要的片断。
⑥酶切后的质粒可以回收备用。
⑦清理桌面垃圾,清洗实验仪器。
2.2.2 质粒的转化
(1)实验原理
质粒DNA粘附在细菌细胞表面,经过42C短时间的热激处理,促进吸收DNA。然后在非选择培养基中培养一代,质粒上所带的抗菌素基因表达,就可以在含抗菌素的培养基中生长。
(2)实验方法
将提取出的质粒pTrcHisC-inpN-gfp转化到JM 109中,具体步骤如下:
① 接JM 109于5 mL LB培养基中,37℃,200 rpm振荡培养过夜。
② 取50 uL接种于5 mL新鲜LB培养基中,37℃培养至对数期(约3-4 h,OD600=0.6-0.8)。
③ 收集菌体,8000 g下4℃离心1 min。
④ 用500 ul预冷的0.1 mol/L的CaCl2洗涤后,重悬于500 ul 0.1 mol/L的CaCl2中2 h。
⑤ 重悬于200 ul预冷的0.1 mol/L的CaCl2中,加1 ul质粒,冰上静置30 min。
⑥ 42℃热激90 s(严格)。
⑦ 立即冰上静置1-2 min。
⑧ 直接涂含Amp的LB平板,37℃过夜培养。
2.2.3 细菌的细胞表面定位实验方法
2.2.3.1 绿色荧光蛋白(GFP)荧光活性的测定
收集相应菌体,用PBS洗涤一遍,再用PBS重悬并调整菌液浓度至OD600为1.0。用荧光分光光度计测量菌液荧光强度,激发波长(Ex)为495 nm,发射波长(Em)为510 nm[2]。
2.2.3.2 大肠杆菌表面展示体系IPTG诱导浓度的优化
挑取MB l08单个菌落,接种于含有Amp(终浓度100ug/mL)的5 mL M9液体培养基中,37oC过夜培养,按1/100的接种量接种子9瓶含Amp的5 mL新鲜M9培养基中,37 oC振荡培养至对数生长期(OD600=0.6-0.8)时,分别向每瓶菌液中加入IPTG,使其终浓度为0 mmol/L,0.05 mmol/L,0.1 mmol/L,0.2 mmol/L,0.3 mmol/L,0.4 mmol/L,0.5 mmol/L,0.8 mmol/L,1.0 mmol/L。室温震荡培养24 h,按照2.2.3.1的方法检测GFP荧光强度。
2.2.3.3 大肠杆菌表面展示体系IPTG诱导温度的优化
挑取MB l08单个菌落,接种于含有Amp的5 mL M9液体培养基中,37℃过夜培养,按1/100的接种量接种于4瓶含Amp的5 mL新鲜M9培养基中,37℃振荡培养至对数生长期(OD600=0.6-0.8)时,向每瓶菌液中加入IPTG(优化的IPTG浓度),分别置于15℃,20℃,28℃,37℃震荡培养24 h,按照2.2.3.1的方法检测GFP荧光强度。
2.2.3.4 大肠杆菌表面展示体系IPTG诱导时间与菌体生长关系
挑取MB l08单个菌落,接种于含有Amp的5 mL M9液体培养基中,37℃过夜培养,按1/100的接种量接种于含Amp的新鲜M9培养基中,37℃振荡培养至对数生长期(OD600=0.6-0.8),分别测定菌落OD600值和GFP荧光强度,加入IPTG(优化的IPTG浓度)震荡培养,每隔4 h取一份培养液样品,用PBS洗涤并重悬,分别测定OD600值和GFP荧光强度。保持吸光值测定范围在0.5-0.8之间,当吸光值超过这个范围时,应用PBS按一定比例稀释0.5-0.8,所得的值乘以稀释倍数即反映真实的细菌浓度。 大肠杆菌细胞表面展示条件的初步优化和实验分析(6):http://www.751com.cn/shengwu/lunwen_198.html