2.2.2仪器设备
表2-1 仪器设备
Table 2-1 The instruments and equipments
仪器名称 型号 生产厂家或地址
高速冷冻离心机
超净工作台
电热恒温水浴锅
Eppendorf移液器系列
紫外分光光度计
超低温立式冰柜
掌上离心机
电子天平
制冰机
PCR仪
微波炉
荧光定量PCR仪
台式高速离心机
电泳仪
普通冰箱 3-18K
SW-CJ-1B
21-6
200uL，100uL，20uL，10uL
NANODROP 2000C
MDF-382E
WTL
BP211D
FM70A
GeneAmp® PCR System 9700
WD700
CFX96
1-13
DYY-12型
BCD-257SL SIGMA公司
苏州
江苏常熟
德国
GBC公司
日本三洋
中国
德国Sartorious
中国格兰特
佛山格兰仕公司
美国Bio-Rad公司
SIGMA公司
北京六一
海尔
2.2.3 试剂
无水乙醇、DEPC-超纯水、RNAiso Plus（裂解液）、氯仿、NaCl、液氮、异丙醇、PCR定量试剂盒、琼脂糖
反转录CDNA试剂盒：①gDNA Eraser ②5*gDNA Eraser Buffer ③prime suipt RT Enzyne mirl ④5*prime suipt Buffer2（for real time） ⑤RT Prime mix ⑥RNase Free dH2O⑦Easy Dilution(for real time PCR)
2.3方法
2.3.1提取的各组织的总RNA[11,12]
(1) 向研钵、剪刀、镊子等沾取少量酒精点燃灭菌，加入液氮冷却。迅速加入适量山羊组织样品并不断倒入液氮至研磨成粉末。
(2) 加入1 mL的裂解液，盖上锡箔纸，静置30min。将样本移去1.5 mL EP管中，冰盒静置5 min。设置高速冷冻离心机温度为4℃，转速12,000 r/min,离心5min。
(3) 取出上清液移到EP管中，加入0.2mL氯仿，盖紧离心管，用力振荡15s，等到溶液充分乳化，称重配平，在冰盒静置5 min，离心16 min。
(4) 取出上清液到新管中，加入等量的异丙醇，充分混匀后称重配平。在23℃恒温锅水浴10min，最后离心10min。
(5) 留下白色沉淀，顺着离心管徐徐加入1 mL 75%的乙醇，轻柔的洗涤离心管壁。离心5 min，弃去所有乙醇。
(6) 室温下干燥沉淀5 min，加入RNase-free dH2O，慢慢地用移液枪吹打，至沉淀完全溶解，放在-80 ℃冰箱中保存。
2.3.2 检测提取出的RNA的浓度
用紫外分光光度计（Cintra）来进行RNA浓度检测。使用后用超纯水洗涤3次。OD260/280值应该在1.8-2.0之间，假如R小于1.8则蛋白质可能被污染，大于2.2则RNA可能已经降解。同时，OD260/230 要大于2.0、小于2.4，假如低于2.0则裂解液中有机溶剂可能没有去除干净。如果实验结果不符合上述要求，要重新提取RNA。
2.3.3 RNA逆转录成cDNA
（1）反转录前，把DNA酶加入提取的RNA中，去除基因组的DNA。
（2）配置反应液：一般为了减少误差要做多组实验，反应液量配置要多于实际量。反应液的成分如下：②5*gDNA Eraser Buffer 2.0uL ;①gDNA Eraser 1.0 uL ; Total RNA 最多1ug ; ⑥RNase Free dH2O 加到10.0uL.
（3）把反转录仪温度升到42℃，把配好的反应液静置2分钟。
（4）配置Master Mix：把参与反应的混合液配好放在冰上，我们要按多于反应数2的量配制Master Mix，然后等量分到反应管中。Master Mix溶液成分如下：③Prime Script RT Enzyne Mix 1.0uL ;⑤RT Prime Mix 1.0uL ; ④5xPrime Script Buffer2 4.0uL ; ⑥RNase Free dH2O 4.0uL ; ACTC1基因在徐淮山羊胎羊组织表达差异研究(3):http://www.751com.cn/shengwu/lunwen_54098.html