（5）将Master Mix溶液加入反应液，整个反应体系是20.0uL，时间为20min。放在PCR仪上在37℃下运行15min，在85℃运行5s，最后降至4℃结束。结束后，将样品取出放在-20 ℃冰箱内备用。

2.3.4  PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳

（1）聚合酶链式反应是PCR（polymerase chain reaction）的全称，是一种基因扩增技术。PCR能通过微量的DNA模板，在短时间内拷贝出数以百万计的DNA，因此作为有效解决DNA含量少从而难以分析检测的问题的常用方法。鉴于PCR具有时效快、操作方便、敏感度高、特异性强的优点，PCR技术被普遍应用于诊断遗传疾病、基因克隆和DNA测序、古生物学等领域。PCR 反应的参与成分包括：①DNA母链，用于提供DNA复制的模板。②引物，使得DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸源!自`751'文"论(文`网[www.751com.cn。③4种脱氧核糖核苷酸，作为合成子链的原料。④耐热的DNA聚合酶，用来催化合成DNA子链。⑤解旋酶，用来打开DNA双链。构成PCR变性-复性-延伸的三个反应是：①DNA母链的高温变性：当温度加热到93℃左右，双链DNA解聚为单链，为下轮反应做准备；②引物的低温退火：当温度降到55℃左右，加入两种与DNA两端序列互补的脱氧核苷酸片段作为左右引物与两条单链DNA 结合；③引物的适温延伸：将温度加热到72℃左右，DNA模板—引物结合物按半保留复制以及碱基配对原则，在耐热的DNA聚合酶的催化下，用溶液中的4 种脱氧核糖核苷酸为反应原料，合成新的DNA链。

整个扩增反应体系是20.0uL，加入10uLMaster Mix溶液和SYBR、1.0uL上游引物和1.0uL下游引物、1.0uL cDNA和7.0uLPCR水。混合后摇匀，放置在PCR仪中，扩增条件为95℃ 4min，94℃ 30s，60℃ 30s ，72℃ 1min（循环34次），72℃ 10min,完成后保存在4 ℃环境。