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摘要：本文主要利用金纳米粒子的暗场显微成像从微观角度去测定肝素钠的含量。在金纳米表面修饰一种能够特异性结合肝素钠的抗凝血酶Ⅲ，通过观察单个金纳米粒子局域表面等离子共振峰（LSPR)位移的变化，从而实现在单分子层面上对肝素钠含量的测定。 37372
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毕业论文关键词： 金纳米粒子 LSPR 肝素钠 抗凝血酶Ⅲ
Gold Nanoparticle Localized Surface Plasmon Resonance Spectral Imaging for detecting heparin
Abstract: In this paper, the use of dark-field microscopy imaging to determine the content of gold particles from the microscopic point of heparin. In the gold surface modification capable of specifically binding to heparin, antithrombinⅢ(ATⅢ), by observing the inpidual gold nanoparticles peak localized surface plasmon resonance (LSPR) change of displacement, to achieve at the single molecule level determination of heparin sodium.
Keywords: Gold Nanoparticle, LSPR, Heparin, AntithrombinⅢ
前言 纳米技术[1]是20世纪80年代末，90年代初才逐渐发展起来的前沿，交叉性新兴学科领域，它在21世纪迅猛发展将促使几乎整个工业领域产生一场革命性的变化[2]。纳米材料的物理及化学性质与粒子本身的尺寸和形状密切相关，制备各向异性的纳米材料变得尤为重要，而纳米材料制备技术的进展使得制备可控尺寸及随着纳米材料技术的迅速发展，贵金属纳米粒子逐渐引起了人们极大的兴趣，主要是由于其具有良好的导电性、小尺寸效应、量子隧道效应及高的表面化学活性[3-8]，使其在生物和化学传感领域具有很大的潜在基础研究和实际应用价值。 入射光激发金属粒子表面的自由电子使其发生集体振荡，当入射光频率与自由电子集体振荡频率相等时达到共振，并在紫外可见消光光谱中表现出特有的消光峰[9]。LSPR性质与纳米粒子的组成、尺寸、形状、粒子间距和周围介质折射率等一些因素有关[10]。许多课题组利用金纳米粒子的局域表面等离子共振对外围介质变化的敏感性制备各种传感器件。例如利用外围介质的组成、大小、形状的变化，从而获得局域表面等离子体共振光谱，然后对其光谱进行分析，可以研究纳米粒子的微观组成。这种技术在生物传感技术、光电子器件、生命科学等领域具有许多重要的应用。 肝素钠(heparin sodium)是一种硫酸化的、带高负电荷的酸性粘多糖混合物，由葡萄糖胺磺酸、葡萄糖磺酸、艾杜糖醛酸等通过糖苷键连接而成的重复二糖单元组成的线性链状分子，是一种有效的硫酸酯类抗凝药物，具有较强的酸性，并带有高度负电荷。它能够与肝素钠特异性结合，从而增加抗凝血性能。近年来的研究表明:肝素钠不仅具有抗凝、抗血栓形成及调节血脂的作用，还具有抗过敏、抗病毒、抗癌等功能,广泛用于防治各种静脉血栓或栓塞、脑血管病、动脉硬化和降低胆固醇，以及防止各种癌细胞的转移等病症[11]。
对于不同的疾病，肝素钠有不同的最适剂量，肝素钠用量过大时会产生自发性出血。因此，研究人体血样中肝素钠含量的测定显得非常重要。 肝素钠的测定常用的是生物法和化学法[12]，但受生物个体的影响较大,稳定性不好[13]。此外,高效液相色谱(HPLC)法[14]、毛细管电泳法[15]、分光光度法[16,17]也应用于肝素钠的测定。分光光度法灵敏度不高,电化学方法则易受到溶液中氧的干扰,毛细管电泳法和HPLC法需要昂贵的仪器,操作不便。本文通过将将打有直径约为5 mm,厚度约为3 mm的小孔的PDMS覆盖在载玻片上，小孔作为一个微型的反应容器，金纳米粒子固定在表面硅烷化巯基试剂的载玻片上，然后将金纳米粒子裸露在外面的部分修饰上含有S-S及-COOH的试剂DDA,最后通过一个简单的反应将在金纳米粒子表面修饰上抗凝血酶Ⅲ，使对肝素钠的检测更具有特异性，灵敏性（如原理图1）。透射光栅是衍射光栅中的一种，利用多缝衍射原理，可使复合光发生色散。 本实验在检测器 EMCCD 前面安装一个透射光栅，然后对单个量子点进行光谱成像（如原理图2）。其中=Ld/S，为散射光波长，S 为透射光栅到EMCC芯片之间的距离，d 为光栅常数，L 为一级条纹中心与零级光斑中心之间的距离。本实验室已经通过一种简便的方法测得d/S 的值为2.89[18]. 图2. The scheme of transmission grating based spectral imaging dark-field microscopy. 仪器与试剂 电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）、TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）、F-4500荧光分光光度计（日立公司）、IX71倒置式研究型显微镜（奥林巴斯（Olympus）,日本） 、电子倍增耦合器件（EMCCD, 产于北爱尔兰） 、 79-1型磁力加热搅拌器（上海浦东光学仪器销售部） 、载玻片（25×75mm， 江苏世泰实验器材有限公司）、盖玻片（18×18-1 mm， Fisherfinest）、微量移液器（大龙兴创实验仪器（北京）有限公司） 、美国OAKTON酸度计(上海谷雨有限公司） 、数据分析软件ImageJ（美国国家卫生研究院，美国）等。 金纳米颗粒(90 nm , Loveland, CO），肝素钠粉末（国药集团试剂有限公司,冰箱冷藏保存，用时配置） ， 4,4′-Dithiodibutyric acid (DDA， ),N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloridee (EDC,东京化成工业株式会社)，Antithrombin III(上海东风生物试剂公司），PDMS(中间打有小孔直径约5 mm，铬酸洗液（实验室自配），实验均用二次蒸馏水（Thermo SCIENTIFIC）,试剂均为分析纯。 实验部分 3.1 载玻片的硅烷化 1.载玻片、盖玻片的洗涤：首先挑选表面光滑无擦痕的载玻片和盖玻片，放到架子上。然后将其浸没在铬酸洗液中，水浴锅70 ℃恒温半小时。最后用二次水洗净，超声三次，100℃烘干2 h，备用。
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