本试验以烟草为试验材料,用GV3101根癌农杆菌介导重组载体的转导,希望能为植物MAPK C族基因的研究作出一定的贡献。近年来,国内外的学者对烟草转化体系的研究已经较为成熟,本试验借鉴已经研究出的结果建立的番茄MPK2基因烟草遗传转化体系期望能对番茄MPK2基因的研究可以对植物MAPK基因功能作进一步诠释奠定一定的基础。
1材料与方法
1.1试验材料与仪器
1.1.1材料
烟草品种珊西、质粒pCAMBIA2301-MPK2、转化受体菌大肠杆菌、GV3101根癌农杆菌等试验材料,均由周口师范学院植物遗传与分子育种重点实验室提供。
1.1.2主要仪器
琼脂糖凝胶电泳仪;中速离心机;摇床;无菌工作台;PCR仪;分光光度计;pH计。
1.2 试验方法
1.2.1无菌苗的培养
将烟草种子用体积分数75%酒精浸泡30s,用蒸馏水冲洗2~3遍,再用5%次氯酸钠溶液消毒8~10min,用无菌水冲洗3~5次,将种子散播在MS培养基上。待其长出小苗,转移至盛有MS培养基(pH=5.8)的花瓶中,放于25℃,周期为16h的光照,8h的黑暗的组培间中,得到烟草无菌苗,待用。
1.2.2珊西烟草的再生
配制MS+6BA(3 mg/L)+蔗糖3%+NAA(0.2 mg/L)培养基,调培养基pH=6.06。将无菌苗于无菌水中切成1.0cm×1.0cm左右的叶盘直接放于配制好的培养基中,25℃,周期为16h的光照,8h的黑暗的组培间中培养观察再生情况。
1.2.3根癌农杆菌活化
①随机挑取含有质粒pCAMBIA2301-MPK2的GV3101根癌农杆菌单菌落接种于LB添加有25 mg/L利福平和50 mg/L卡那霉素的选择培养基中,28℃,240 r/min,过夜摇,至OD600值为0.5左右。
②然后5000 r/min,6min,离心,其沉淀用1/2 MS液体培养基重新悬浮备用。
1.2.4农杆菌感受态的制备及转化
①吸取GV3101根癌农杆菌菌液于YEB中,加利福平100 mg/L,28℃,220 r/min,过夜摇14~16h。
②次日按1:50的比例加入新鲜的YEB中,220 r/min,摇3~4h至菌液OD600值在0.6~0.8之间。
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