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2.1.3 酶与酶缓冲液 9
2.1.4 试剂盒 9
2.1.5 培养基 10
2.1.6 其他试剂 10
2.2 仪器及设备 11
2.3 实验方法 11
2.3.1 质粒的构建 11
2.3.2 随机点突变文库的建立 13
2.3.3 酵母转化 14
3 结果与讨论 16
3.1 Mn2+驱动的mis16随机突变PCR产物电泳图 16
3.2 大肠杆菌转化株实验组与对照组比较 16
3.3 单克隆菌落所含质粒的酶切分析与阳性率 17
3.4 mis16序列比对结果 18
3.5 酶切获得up500bp-mis16-hph- down500bp片段电泳图 18
4结论 19
5实验展望 19
致谢 20
参考文献 21
1 绪论
表观遗传(epigenetic inheritance)指不基于DNA差异的核酸遗传，即细胞分裂过程中，在DNA的序列并不改变的条件下，全基因组的表达调控所决定的表型遗传。其涉及染色质重编程、整体的基因表达调控，如DNA甲基化，组蛋白修饰、核小体定位、增强子、弱化子等[1]。近年来，研究调控细胞世代间核小体组装模式遗传的稳定性（epigenetic stability）已成为表观遗传研究的核心内容，但目前对该问题的系统研究基本还是空白。何向伟实验室（浙江大学生命科学研究院）已建立了一套定量及快速、半定量分析核小体表观遗传稳定性的实验系统，运用这些实验系统，对粟酒裂殖酵母（S.pombe）全基因组敲除文库进行筛选，将找到多个乃至所有影响核小体表观遗传的分子途径。该课题也旨在通过对裂殖酵母的研究，了解在着丝粒特殊核小体的表观遗传调控途径中的重要蛋白Mis16，完成核小体表观遗传稳定性研究领域的一小块拼图。
1.1 相关背景知识
1.1.1 裂殖酵母作为模式生物的优势
在多种模式生物中，酵母作为被人们最早认识、研究最深的真核生物之一, 已成为分子生物学研究的常用模式物种。其中, 裂殖酵母和酿酒酵母已经完成全基因组测序、转录组分析、蛋白相互作用网络图, 被广泛用于表观遗传学研究领域。作为模式生物，酵母有着较为突出的优势：(1)酵母基因组含有4970个基因，其中约80%为细胞生存非必需基因，通过逐个敲除非必需基因，已建立了全基因组敲除文库，而将必需基因完全敲除或点敲除能产生明显的致死(lethal)表型或温度敏感(temperature sensitive，TS)表型；(2)酵母无论是在二倍体或者单倍体的状态下都能生长与繁殖, 在实验过程中可依据要求相互转换,这对其基因功能的研究十分有利；(3)酵母的细胞周期短(29oC时,只需150 min就能扩增一倍)，基因组小(其单倍体只含有3条染色体)，易操作，适用于经典的遗传学分析；(4) 与许多复杂的生物种类相比，酵母与它们具有许多相似的生命行为, 特别是在DNA修复、细胞周期调控和减数分裂等方面与人类基因具有高度同源性[2]。
芽殖酵母（budding yeast）的着丝粒包括约125bp的DNA和一个Cse4核小体，因此称为“点状”着丝粒。裂殖酵母（fission yeast）的着丝粒DNA大小分别约为35、65和110kb，比芽殖酵母大300到1000倍[3]。另外，裂殖酵母着丝粒包含大量的DNA串联重复序列，直接介导了异染色质的形成以及后序的转录沉默。因此，裂殖酵母染色体着丝粒的结构可能代表了高等真核生物的着丝粒结构，对裂殖酵母的研究将更有助于人们了解高等真核生物[3]。
1.1.2 核小体表观遗传稳定性