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    以EIN2基因的特异性引物为测序引物,将重组质粒送至金斯瑞生物科技有限公司进行测序鉴定。
    1.2.5 质粒pYY13单酶切及切胶回收纯化
    质粒pYY13用PstⅠ进行单酶切处理,37℃水浴2h,65℃水浴20min将酶灭活。电泳后采用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收质粒。
    1.2.6 质粒pYY13与目的基因EIN2的连接反应
    将PCR产物和单酶切后的pYY13经SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒纯化后,对目的基因和质粒进行T4 DNA聚合酶处理,将目的基因连接上接头(dATP)n,pYY13连上接头(dTTP)n。反应条件:65℃ 30min,75℃ 20min。PCR产物连接反应体系:纯化后的PCR产物10μL,dATP 2μL,T4 DNA polymerase 1μL,10×T4 DNA polymerase buffer 4μL,加双蒸水至20μL;单酶切质粒连接反应体系:单酶切过的pYY13 10μL,dTTP 2μL,T4 DNA polymerase 1μL,10×T4 DNA polymerase buffer 4μL,加双蒸水至20μL。
    分别取上述处理过的目的基因5μL和质粒1μL混合,22℃水浴10min,再75℃水浴2min,完成连接反应。
    1.2.7 感受态细胞的制备和目的基因的转化
    操作同1.2.3。
    1.2.8 重组载体pYY13-EIN2的检测与鉴定
    重组载体pYY13-EIN2的PCR鉴定和测序鉴定分别按照1.2.4的操作进行。
    2. 结果与分析
    2.1 番茄总RNA的提取与cDNA的扩增
    如图所示,以番茄为材料提取其总RNA,得到较高质量的RNA(图1)。然后以总RNA为模板进行RT-PCR扩增其cDNA(图2)。
     
    图1 番茄总RNA
     
    图2 cDNA的电泳结果
    注:M:DL5000 Marker;1:cDNA产物
    2.2 目的基因的克隆
    以cDNA为模板,用EIN2的特异引物进行PCR扩增目的基因(图3),其条带大小约为400bp,和预期结果一致。
     
    图3 EIN2产物的电泳结果
    注:M:DL2000 Marker;1-3:EIN2 PCR产物
    2.3 重组载体pMD18-T-EIN2的PCR检测结果
    分别提取重组载体进行PCR验证,同时以纯水作为阴性对照。以重组载体为模板扩增出约400bp的条带,而阴性对照未扩增出任何条带(图4)。
     
    图4 pMD18-T-EIN2重组质粒的PCR检测
    注:M:DL5000 Marker;1:重组质粒pMD18-T-EIN2;2:阴性对照
    2.4 重组载体pMD18-T-EIN2的测序结果
    将重组的阳性质粒送至金斯瑞生物科技有限公司进行测序,通过单向测序结果证实,目的基因EIN2成功插入到pMD18-T载体中,说明重组载体构建准确无误(图5)。
     
    图5 pMD18T-EIN2重组阳性质粒的部分测序结果
    2.5 pYY13质粒单酶切
    由于pYY13质粒有两个PstⅠ酶切位点,经酶切反应后得到两条带,较小的那条带是位于两个PstⅠ酶切位点之间的一段自杀基因(ccdB基因)序列(图6),切胶回收较大的那条带。
     
    图6 pYY13单酶切电泳图
    注:M:DL5000 Marker;1-2:未经单酶切处理的pYY13;3-4:pYY13单酶切产物
    2.6 重组载体pYY13-EIN2的PCR检测结果
    提取重组质粒和空质粒pYY13,分别以之为模板进行PCR扩增。以重组载体为模板扩增出约400bp的条带,而空质粒未扩增出任何条带(图7)。
     
    图7 pYY13-EIN2重组质粒的PCR检测
    注:M:DL5000 Marker;1-2:重组质粒pYY13-EIN2;3:pYY13空载对照
    2.7 重组载体pYY13-EIN2的测序结果
    将重组的阳性质粒送至金斯瑞生物科技有限公司进行测序,通过单向测序结果证实,目的基因EIN2成功插入到pYY13载体中,说明VIGS载体构建准确无误(图8)。
     
    图8 pYY13-EIN2重组阳性质粒的部分测序结果
    3. 讨论
    本研究所用的病毒载体为烟草脆裂病毒载体pYY13,经pYY12和pYL170改造而成。该质粒含有两个接头,有利于外源基因的插入。并且两个接头之间被插入了一个自杀基因(ccdB基因),含这种基因的载体或者质粒只能在特定的菌株(DB3.1)中存活,不能够在大肠杆菌DH5α中存活,利用这一特性,可以在一定程度上避免假阳性现象,有利于高效回收正确的阳性克隆[14]。TRV-VIGS载体具有插入外源基因长(高达1kb以上)、持久性长、诱导基因沉默的效率高、可侵染花和分生组织等器官以及引起宿主温和病症等优点,已经成为病毒诱导的基因沉默的主要载体[15-16]。
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